Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile In Vitro Gübreleme

Zebra balığı, daha yüksek omurgalılarla genetik benzerlikleri nedeniyle gelişimsel biyoloji ve insan hastalıkları araştırmaları için güçlü bir model sistemdir. Bu protokol, erken embriyogenez için gerekli olan genlerdeki resesif mutasyonları tanımlamak için ileri tarama stratejileri için kullanılabilecek haploid zebra balığı embriyoları oluşturmak için bir metodolojiyi açıklar.

Bu prosedürün genel amacı, in vitro fertilizasyon ile haplo zebra balığı embriyoları üretmektir. Bu, önce yetişkin erkek zebra balıklarından olgun spermin izole edilmesi ve ardından sperm örneklerinde bulunan baba genomlarını devre dışı bırakmak için ultraviyole ışınlama yapılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, döllenmemiş yumurtaları yetişkin bir dişi zebra balığından izole etmektir.

Daha sonra, XR UV ile inaktive edilmiş sperm örneği ile döllenir. Son adım, tüm C dağı iki hibridizasyonunu kullanarak bir morfoloji tahlili veya gen ekspresyonu analizi gibi gelişimsel analize kadar haploid debriyajı geri almaktır. Haplo zebra balığı embriyolarını kullanmanın temel avantajı, bu tekniğin daha az nesil kullanan verimli ileri genetik taramalar sağlaması ve böylece zamandan ve hayvan alanından tasarruf sağlamasıdır.

Bu yöntem, böbrek oluşumu için gerekli olan genlerin tanımlanması gibi gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, zebra balığı gametlerinin toplanmasında teknik zorluklar olabileceğinden mücadele edeceklerdir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü araştırmacıların olgun av hayvanlarını toplamak için yetişkin zebra balıklarını nasıl kullanacaklarını öğrenmelerine yardımcı olacaktır.

Başlamak için Hank Stok Çözeltilerini ve Hank'in önceden karıştırılmış çözeltisini hazırlayın. Ardından, haplo debriyaj koleksiyonu için istediğiniz sayıda yetişkin zebra balığı dişisini seçin. Seçildikten sonra, her bir yetişkin zebra balığı dişisini yetişkin bir zebra balığı erkeği ile birlikte bir sistem suyu haznesine yerleştirerek çiftleşme kafeslerini hazırlayın, böylece gece boyunca bir bölücü ile ayrılırlar.

İlk olarak, 10 mililitre damıtılmış suya 0.35 gram sodyum bikarbonat ekleyerek altı numaralı taze Hank stok çözeltisini yapın. Çözünmesi için iyice karıştırın. Ardından, tamponlanmış Hanks'in son çalışma solüsyonunu buz üzerinde bir tüpte yapın.

Karıştırdıktan sonra, mikro santrifüj tüplerinde 500 mikrolitrelik alikot hazırlayın ve döllenme için yeterli sperm toplamak için buzun üzerine yerleştirin. Her sperm hasadı için dört ila beş erkek zebra balığı seçin. Ötenazi yapıldıktan sonra, spermin aktivasyonunu tetiklemeyi önlemek için erkeği fazla sıvıdan dikkatlice kurulayın.

Karın boşluğunu dekapite ettikten ve temizledikten sonra, testisleri yüzme kesesinin yanındaki dorsal vücut duvarı boyunca yerleştirin. Bu stereo mikroskop altında bakıldığında beyaz opak bir görünüme sahiptirler. Yerleştirildikten sonra, testisleri sağlam tutmaya özen göstererek çıkarmak için ince forseps kullanın.

Testisleri sperm çözeltisine yerleştirin ve buz üzerinde saklayın. Tüm erkekler diseke edilene kadar bu adımları tekrarlayın. Tüm örnekler toplandıktan sonra, dokuyu steril bir mikro tüp tokmağı ile nazikçe öğüterek testisleri homojenize edin.

Süpernatanı buz üzerinde küçük bir Petri kabına aktarın. Süpernatan solüsyon ile birlikte doku kalıntılarını aktarmaktan kaçının. Çünkü bu, gölgeler yaratacak ve spermin UV aktivasyonunu tehlikeye atacaktır.

Tüpü 300 ila 400 mikrolitre arasında ek çile omurga çalışma solüsyonu ile durulayın ve bu süpernatan yıkamayı küçük Petri kabına ekleyin. Ardından, çanağı kaynaktan 15 inç mesafede toplam iki dakika boyunca bir tezgah lambasından UV'ye maruz bırakın. Çanağı buz kovasına geri koyun ve ardından UV ile etkisiz hale getirilmiş spermi buz üzerinde saklanan taze bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Bir koleksiyon için seçilen kadınlarda anestezi derinliğini onaylayarak başlayın. Anestezi uygulandıktan sonra, yumurta aktivasyonunu tetiklememek için fazla çözeltiyi dikkatlice çıkarın. Sperm eklenmeden önce, dişiyi temiz bir Petri kabına yan yatırın ve bir elinizle bir veya iki parmağınızı sırt vücut duvarının arkasına yerleştirerek dişinin sırtını desteklerken karnını stereo mikroskop altında görüntüleyin.

Karından yumurtaları sıkmak için diğer elinizin bir veya iki parmağını kullanarak göbeği yaklaşık 10 ila 20 saniye boyunca hafifçe okşayın. Dişinin karnını okşadıktan sonra yumurtalar çok kolay çıkmalıdır. Yumurtalar kolaylıkla çıkmazsa, dişinin zarar görmesine neden olabileceğinden, yumurtaları dişiden daha fazla itmeniz ve zorlamanız tavsiye edilmez.

Çıkarıldıktan sonra, X'i dişiden uzaklaştırmak için ince bir prob veya küçük bir spatula kullanın. Dişiyi nazikçe kaldırın ve onu balık sistemi suyu içeren uygun şekilde etiketlenmiş bir izolasyon tankına geri koyun. Daha sonra, yumurtaların kavramasına 50 mikrolitre UV ile inaktive edilmiş sperm çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin.

Bu süre zarfında, dişi ebeveyne atanan numara ile takip etmek için yemeğe karşılık gelen bir etiket yapıştırın. Daha sonra, yumurtalara bir mililitre E üç çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin. Son olarak, tabağı yarıya kadar doldurmak için yeterli E üç solüsyonu ekleyin ve embriyoları sonraki inkübasyon için 28 santigrat dereceye yerleştirin.

Dört ila sekiz saat sonra, tabağı alın ve döllenmemiş embriyoları çıkarın. Döllenmemiş embriyolar beyaz opak bir görünüm veya şekilsiz tek hücreli şeffaf bir görünüm gösterebilir. Daha sonra, E üç embriyo ortamını taze E üç çözeltisi ile değiştirerek kalan embriyoları yıkayın.

Embriyolar daha sonra istenen zamana, ilgi noktasına kadar inkübe edilir ve çeşitli araştırma uygulamalarında kullanılabilir. Bu görüntü, doğal yumurtlama ile üretilen ve daha sonra yaklaşık 30 HPF'ye kadar kuluçkaya yatırılan diploid vahşi tip embriyoları göstermektedir. Burada haplo embriyolar in vitro fertilizasyon ile üretildi ve gelişimde bir dizi anormallik sergiledi.

Nispeten normal haplolar, bir A haplosunun derecelendirme şemasına benzer şekilde kısaltılmış daha fazla stok gövdesine sahipken, brüt anormallikleri olan haplolar, bir B derecesine karşılık gelen ciddi şekilde kesilmiş bir vücut ekseni sergiledi ve son olarak, C sınıfı düşük kaliteyi temsil eder. Haplos haplo vahşi tipleri, diploid mutantlara kıyasla embriyonik böbrek yapısında normal bir patern sergiledi. Ayrık hücre tiplerinin segmentli modeli, farklılaşmış nefron hücre tiplerine özgü gen transkriptleri hedeflenerek görselleştirilir.

Bu videoyu izledikten sonra, in vitro fertilizasyon ile haplo zebra balığı embriyolarının nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, özellikle dişilerden yumurta toplarken yetişkin zebra balığını nazikçe tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, pro naro'nun segmentleri gibi hücre tiplerinin gelişimini değerlendirmek için tüm Mountain C iki hibridizasyonu, gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Ultraviyole radyasyon kaynaklarıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman göz koruması gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.