Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

Testis fare hücreleri için bir transfeksiyon tekniği Spermatogenezisin benzersiz süreçleri incelemek için bu makalede, in vivo mikroenjeksiyon ve fare testis Elektroporasvon açıklar. Sunulan protokol, elektroporasyon ile cam kılcal hazırlanması götürücü kanalı yoluyla mikro-enjeksiyon, ve transfeksiyon adımlar içerir.

Bu prosedürün amacı, fare testisine genetik yapıların mikroenjeksiyonunu ve ardından InVivo elektroporasyonu gerçekleştirmektir. Bu, spermatogenez ve testis fonksiyonuna odaklanarak kapsamlı gen analizinin yapılmasına izin verir. Bu, önce doğrudan PrepU bezlerinin üzerinde bir abdominal kesi yoluyla testise erişim sağlanarak gerçekleştirilir.

İkinci aşama ise testisin bağlı olduğu efferent kanalın damarı yağ dokusundan serbestleştirerek mikroenjeksiyona hazır hale getirilmesidir. Daha sonra, KBB kanalı yüklü bir mikroenjeksiyon pipeti ile delinir ve leke genetik yapı solüsyonu testiküler feröz tübüllere uygulanır. Son adım, testisin çok taraflı elektroporasyon transfeksiyonudur.

Sonuç olarak, transfekte edilen testis, kullanılan rapor edilen gen yapılarına bağlı olarak floresan mikroskobu veya luminometre ölçümleri ile transfeksiyonu değerlendirmek için üç gün sonra çıkarılır. Geçici bir transfeksiyon yöntemi olarak fare testisi için mikroenjeksiyon akıl operasyon tekniğinin bu kombinasyonu, transgenik hayvanlar veya nakavt fareler gibi mevcut yaklaşımlara göre kesinlikle birçok avantaj sağlayacaktır. Hızlı bir performans, düşük maliyet ve sadece orta düzeyde teknik becerilere ihtiyaç duyulmasını sağlar.

Bu metodolojik yaklaşım, erkek doğurganlık araştırmaları alanındaki mevcut tekniğe umarım akıllıca olabilir. Deneysel genis ve doğurganlık süreçleriyle ilgili geniş bir konu yelpazesini ele almak için esasen yararlı olabilir. Bu, özellikle bu yöntemin tüm fonksiyon kaybı deneylerinin kazancı şeklinde genetik analiz için kullanıldığında mümkün olacaktır.

Muhtemelen, örneğin spermatogeneze özgü genlerin düzenleyici unsurlarını araştırmak için de çok yararlı olacaktır. Prosedüre başlamak için, altı ila sekiz haftalık bir erkek fareyi deri altından bire bir% 10 ketamin ve% 2 ksilazin karışımı ile uyuşturun. Ardından, ayak parmağını sıkıştırarak farenin derin anestezi altında olduğundan emin olun.

Kuruluğu önlemek için gözlerine merhem sürün. Ardından, karın kıllarını elektrikli tıraş makinesiyle alın ve ardından cerrahi alanı dezenfekte edin. Karın bölgesinin ortasındaki PrepU bezlerinin hemen üzerinde ventral bir kesi yapın.

Bunun için cildi çekin ve küçük bir enine kutanöz kesim yapın. Sonra karın kas tabakası boyunca devam edin. Bağlı testisi ortaya çıkarmak için karın yağ yastıkçıklarını dikkatlice yukarı çekin ve karın üzerine steril bir kağıda yerleştirin.

Daha sonra, mikroenjeksiyon için KBB kanalını bulmak için bir stereo mikroskop kullanın. Testis ile epididim arasındaki ince damar bileşkesidir ve testis arterinin bitişiğinde bulunur. KBB kanalını kaplayan yağ dokusunu ince forseps ile çıkarın.

Bundan sonra, serbest bırakma kanalını steril bir kağıt şerit üzerine yerleştirin ve kanalın çevreyi bozmadan kolayca görülebilmesini sağlayın. Daha sonra, daha önce renkli plazmit solüsyonu yüklenmiş olan mikroenjeksiyon pipetini mikro manipülatör enjektör ünitesine bağlayın. Bundan sonra, mikro enjeksiyon iğnesini, ucu GYO testisine bakacak şekilde EENT kanalına paralel olarak yerleştirin.

Ardından, kanalı mikroenjeksiyon pipetinin üzerinden sıyırmak için ince cımbız kullanın. Pipeti çekerken kanala paralel tutulduğundan emin olun. İğneyi dikkatlice testise doğru yönlendirin ve tunika albuginea'nın hemen altındaki GYO testisine nüfuz ettiği gibi durun.

Ardından, mikro enjektörün parametrelerini ayarlayın. Daha sonra, gen yapı çözeltisini enjekte etmeye başlayın. Testis dolum durumunu gözlemleyerek tüm enjeksiyon sürecini izleyin.

Renkli plazmit çözeltisinin yardımıyla, testisi hacminin sadece üçte ikisine kadar oluşturun. Etkili elektroporasyonu mümkün kılmak için. Yeterli iletkenliği sağlamak için cımbız elektrotlarını bir kez PBS'ye batırın.

Daha sonra testi ıslak elektrotlar arasına hafifçe sıkıştırın ve elektro parata ile elektrik direncini ölçün. Daha sonra, elektroyu yeterince ayarlayın ve testise toplam sekiz kare darbe ile akım uygulanabilmesini sağlayın. Dört farklı testis bölgesinde, elektroporasyonu tüm testis çevresinde kapsamlı bir şekilde gerçekleştirin.

Elektroporasyon bittikten sonra, testisi tekrar karın içine orijinal konumuna mümkün olduğunca yakın bir yere yerleştirin. Yani iç kas tabakası emilebilir cerrahi sütürdü. Daha sonra cildi dikiş klipsleri ile kapatın.

Farenin anesteziden kurtulmasına izin verin. 37 santigrat derece ısı yastığı üzerinde ısıtılmış steril bir kutuda, biraz kağıt havlu ile hazırlanmış. Ped, kafesin sadece yarısının ısınmasını sağlamalı ve bir ısı gradyanı oluşturmalıdır.

Ek olarak, stresi daha da azaltmak için fareyi başka bir kağıt havluyla örtün. Hayvan tamamen uyandıktan sonra, onu yeni, temiz, tam donanımlı bir kafese aktarın. Ancak daha fazla iyileşme, fareyi nihayet hayvan tesisine geri getirene kadar kurtarma işlemini izleyin.

Bu şekil, floresan tespiti ile in vivo elektroporasyondan üç gün sonra tüm Mount testislerini göstermektedir, bir C 57 siyah altı farenin transfekte testisleri, gösterilen gelişmiş yeşil floresan proteini veya kırmızı floresan proteini göstermektedir. İşte bir testisin histolojik bölümleri. PE eeg, FPC one ile tek taraflı elektroporasyondan üç gün sonra, transfekte edilmiş Seminifer tubial hücreler, tipik küresel olarak organize edilmiş yapılarıyla birlikte yeşil floresan ile gösterilir.

Çekirdekleri mavi renkte iki pro üç ile karşı boyandı. Bu prosedürü gerçekleştirirken, KBB kanalını tanımlama ve yağ dokusunu serbest bırakma süreçlerinin oldukça karmaşık olduğunu akılda tutmak önemlidir. Bu nedenle, gerçek in vivo deneyimi gerçekleştirmeden önce ölü hayvan üzerinde pratik yapabilirsiniz.

Mikroenjeksiyon elektroporasyonun anti progresyonu ve son test hasadını takiben, Q-R-T-P-C-R gemisi ve Western blotlama gibi birçok tekniğin uygulanması mümkündür. Bu nedenle, test edici genin xining'i, protein ekspresyon modellerinin yanı sıra translasyon sonrası modifikasyonlar da kabul edilir. Dolayısıyla, bu araçlar aracılığıyla, örneğin spermatogenez gibi, altta yatan karmaşık mekanizmalar ve düzenlemeler ile çok çeşitli konulara saldırılabilir.