Name: Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin fare testisinde mikroenjeksiyon ve elektroporasyon ile gen transferi yöntemini. Bu teknik spermatogenez ve testis fonksiyonlarını in vivo araştırmak için hızlı ve düşük maliyetli bir çözüm sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz testis mikroenjeksiyon öğretmek için Münster Üniversitesi Üreme Tıbbı ve Androloji Merkezi Birgit Westernstroeer teşekkür ederim. Ayrıca, biz Ursula Antkewitz ve teknik yardım için Petra reckling minnettarız. Biz bu işi (WE2458 / 10-1) desteklemek için Alman Araştırma Vakfı (DFG) teşekkür ederim. &#160;

Tüm yapılan hayvan deneyleri yerel etik kurul (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Almanya) tarafından onaylanmıştır. 1. Plazmid Preparasyon <ol><li> Plazmid hazırlanması için, plazmid arıtma kitleri (Malzemeler tabloya bakınız) ya da hayvanın bağışıklık reaksiyonları önlenebilir ve böylece endotoksin çıkartma tampon maddesi ile benzer bir yöntem kullanınız. Kılavuzun yönergeleri izleyin. Plasmid dilüsyon için GKD 2 O kullanır. </li><li> Maksimum hızda (20.000 xg) DNA çözüm iplik artıkları ortadan kaldırın. Daha sonra süpernatan toplamak. </li><li> Bir spektrofotometre (materyalleri görmek) ile plazmid konsantrasyonunu belirleyin. </li><li> 1-3 mikrogram (DNA) / ul GKD 2 O ile plazmid konsantrasyon ayarlayın. Not: Daha yüksek konsantrasyonlar çok viskoz enjeksiyon çözüm neden olabilir iken düşük konsantrasyonlar, transfeksiyon etkinliğini azaltacaktır. Bunun yanı sıra,transfeksiyon verimi plazmidin büyüklüğüne bağlıdır ve ayrı ayrı test edilmesi gerekir. </li><li> Enjeksiyondan önce, bir çözelti, karışımı hazırlamak 5 ul PBS (10x) ve 5 ul Fast Green (% 0.5) ile birlikte, örneğin 40 ul plasmid için. Hızlı Yeşil enjeksiyon işlemi takip için gereklidir. Tercihen, ince duvarlı PCR-tüpleri veya Parafilm kullanın. Not: Testis büyüklüğüne bağlı olarak, 20-50 ul&#39;lik bir hacim testisler için gerekli olacaktır. </li></ol> Mikroenjeksiyon Pipet 2. hazırlanması <ol><li> Mikroenjeksiyon pipetler hazırlanması için borosilikat kılcal damarları (Malzemeler tabloya bakınız) kullanın. </li><li> Dikey kılcal çektirmesi ile cam kılcal damarları çekin (Malzemeler tabloya bakınız). </li><li> Usulca bantlama forseps ile kılcal ucunu kırmak. Ucu genellikle 50-80 mm çapında ve yaklaşık 1 cm uzunluğundadır. Bu dokuya nüfuz kadar sert değildir gibi çok uzun ipuçlarını kaçının. </li><li> Son, sha atBir mikropipet beveler (Malzemeler tabloya bakınız) kullanılarak 45 ° açı 30 derece ucu rpen. </li><li> Enjeksiyon solüsyon karışımı ile mikroenjeksiyon pipet yükleyin (plazmid Hazırlama bakınız). Küçük bir şırınga ile cam kılcal arkasına çözümü uygulayın. Not: iletkenliği azaltmak hem de muhtemelen doku hasarına neden olur böylece, aksi takdirde, bu çözelti ile birlikte plazmid seminifer tüp içine enjekte edilecektir, yükleme sırasında, hava kabarcıklarını önlemek için deneyin. </li></ol> 3. Anestezi ve Cerrahi <ol><li> Steril (yani, şırınga, iğne, cerrahi aletler, vb) malzeme kullanılarak aseptik koşullarda işlemi gerçekleştirin. Bu hayvanın enfeksiyonu azaltmak ve iyi sağkalım oranları sağlayacaktır. </li><li> 6-8 haftalık bir yaşta elektroporasyon için erkek fareler kullanın. </li><li> Cerrahi sonrası analjezik tedavi başlatmak için, analjezikler ile fare ameliyattan önce günde içme suyu eklendi sağlar. Bu götkuvvetle muhtemel cerrahi sonrası hypodipsia (azaltılmış su emme) durumunda önleyici bir analjezi etmiş olur. Bu amaçla, örneğin, bir çocuk, ibuprofen süspansiyonu (20 mg / ml) ile içme suyu maruz kalmaktadır. İlaçlı içme suyu da günde bir ve aynı konsantrasyonda iyileşme iki temin edilmelidir. Bu C57BL / 6J yaş 8 hafta boyunca 25 g, 5 ml / g içme suyu ve vücut ağırlığı için geçerli bir 7.5 mg / kg arasında günlük bir doz anlamına gelir. Bu analjezik rejimi temel bir ağrı ve yüksek refah 26 ile birlikte hızlandırılmış kurtarma garanti. </li><li> (Malzemeler tabloya bakınız): 1 oranında cerrahi gününde çalışma çözeltisi anestezi hazırlanması için, 1% 10 Ketamin ve% 2 ksilazin karıştırın. </li><li> Anestezi sıvısı deri altından 0.25 ml 100 mg / vücut ağırlığı tatbik ediniz, hayvan anestetize için (Ketamin = 0.125 g / kg, ksilazin = 0.025 g / kg). Farelerin organ hasarı ve yaralanmaları önlemek için pelvik ve ekstremite arasında bir enjeksiyon sitesini kullanın. Genellikle, 10 dakika ihtiyaç vardırkadar fare derin anestezi. </li><li> Anestezi sırasında kuruluğunu önlemek için veteriner merhem ile fare gözleri örtün. </li><li> Yanıt toplam eksikliği tarafından fark edilir derin anestezi tutuklama, sınayın. Bu amaçla, sadece hayvan ayak tutturulur. </li><li> Ameliyat başlatmak için, bir elektrikli tıraş makinesi veya benzeri ile karın tüylerini ve STERILIUM veya benzeri ile çalışma alanı dezenfekte. </li><li> Doğrudan karın bölgesinin merkezinde Sünnet bezlerinin üstünde bir ventral kesi yapmak. O yerde, ilk deplasman cilt çekin ve yaklaşık 8-14 mm&#39;lik küçük enine deri kesim yapmak. Daha sonra, abdominal kas tabakası boyunca devam eder. Not: hayvana zarar azaltılması için mümkün olduğunca lezyon kadar küçük olmalıdır. </li><li> Ekli testis ortaya çıkarmak ve sadece kesi yerinde (Şekil 2A) yanında bir önceki hazırlanmış su geçirmez tek kullanımlık kağıt örtü üzerine yerleştirmek için dikkatle karın yağ yastıkları yukarı çekin. </li><li> F dürbün kullanınenjeksiyon hedef olarak götürücü kanalını ind. Duktus efferent testis ve epididimis arasındaki ince damar kavşak olarak tanımlanır. Bu önemli testis arter bitişiğinde yer almaktadır. Duktus arter 45 ° &#39;lik bir açıyla neredeyse çalışır ve gözle kaput epididimisdeki girer. Not: fare yaşına bağlı olarak, duktus genellikle yağ dokusunda gömüldü. </li><li> Bu yağ dokusu efferent kanalını temizlemek için ince forseps kullanın. Daha sonra, çevre bozmadan kanalının net bir görüş sağlamak için steril kağıt şerit üzerinde serbest duktus yerleştirin. </li></ol> 4. Mikroenjeksiyon ve DNA Uygulaması <ol><li> Mikromanipülatör / enjektör ünitesine plazmid çözüm ile yüklenir mikroenjeksiyon pipet, bağlayın. </li><li> Ucu rete testis (Şekil 2B) bakacak olan götürücü kanala mikroenjeksiyon iğne paralel yerleştirin. </li><li> Ince cımbız kullanın vemikroenjeksiyon pipet kanalı üzerinde şerit. Bunu üzerine çekerken kılcal kanala paralel tutulur emin olun. Not: Bu yordam mikromanipülatör ile iğne hareket ettirerek gemiyi nüfuz daha uygundur. </li><li> Testis doğru dikkatlice iğneyi yönlendirmek ve bu tunika albuginea (Şekil 2C) altında direkt rete testisi nüfuz olarak sadece durdurmak. Not: retenin testis overreaching durumunda, plazmit çözelti ara boşluk içine akar. Bu genellikle seminifer tübüller transfecting yetmezliğine yol açar. </li><li> Pi: 100 hPa, ti: 0.2 sn, ve pc: 0 hPa (Şekil 2B) plazmid çözüm enjeksiyon için aşağıdaki ayarları ile mikropüskürtücüden kullanmaktadır. </li><li> Yeşil renk yardımıyla durumunu doldurma testisi gözlemleyerek tüm enjeksiyon sürecini izlemek. Testis sadece pl ile hacmine 2/3 kadar dolu olduğunu özenasmid çözeltisi (Şekil 2E). Not: enjeksiyon hacmi aşılırsa, testis dokusu zarar görebilir. </li></ol> Testis 5. Elektroporasyon <ol><li> Etkili elektroporasyon etkinleştirmek PBS (1x) olarak cımbız elektrotlar emmek için. Bu, yeterli iletkenlik sağlar. </li><li> Sorunsuz ıslak elektrotlar (Şekil 2F) arasındaki testis sıkmak. Elektroporatörü ile elektrik direncini ölçün. </li><li> Testis akım uygulayın. 50 msn darbe süresi ve 950 ms aralığı sabit bir zaman süresi ile 4 farklı testis sitelerinde 40 V sekiz kare darbeleri uygulayın. </li></ol> 6. Yara Kapatma ve Post-cerrahi <ol><li> Elektroporasyon bittiğinde, geri özgün konumunda testis yerleştirin. </li><li> Cerrahi sütür (materyalleri görmek) ile iç kas tabakası diker. </li><li> Sütür klipleri (Malzemeler tabloya bakınız) kullanılarak cilt kapatın. Cildi zekâ çekinh cımbız. Kas tabakası dışlamak emin olun. En fazla 5 mm mesafede klipsleri, her bir koyun. Not: cerrahi dikiş fare tarafından yutulabilir Çünkü, sütür klipler cilt lezyonu kapatılması için tercih edilir. </li><li> Fare 37 ° C sıcak pad üzerinde temperli steril boş fare kafes içinde yerleştirilen steril kağıt havlu üzerinde anestezi kurtarmak için izin verin. Ped, bir ısı derecesi oluşturarak kafesin yarısının ısınma sağlamalıdır. Hayvan için bu durum kafeste sıcaklık çeşitli bireysel, en rahat alanı aramak için mümkün kılar. Ek olarak, stres daha da azaltılabilir, böylece steril kağıt havlu tabakası ile fare kapsamaktadır. Not: fare vücut yüzeyi vücut kütlesi ile ilgili olarak olağanüstü yüksek olması nedeniyle daha büyük hayvanlar ile karşılaştırıldığında, termal destek kemirgen başarılı bir şekilde geri kazanılması için özel bir önem taşımaktadır. </li><li> Işletilen hayvan tamamen uyanmış zaman, i aktarmaktam donanımlı bir yeni fare kafesine daha kurtarma için t. Eski kafes ya da bir grup farenin geri hayvan koyma. Kafes yara enfeksiyonu önlemek için mümkün olduğunca temiz ve steril olduğundan emin olun. Tüm kurtarma sürecini izlemek. Tamamen iyileşti ve normal davranmaya görünüyor kadar geri hayvan bakım tesisi için fareyi aktarmak için, bekle. Not: Ek per- ve ameliyat sonrası stratejiler Pritchett-Coming KR ve ark 6 tarafından tartışılmıştır. </li></ol>

<ol><li>Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fact+or+fiction%3A+In+vitro+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Fact or fiction: In vitro spermatogenesis.</a> Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).</li>
<li>Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+in+vitro+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Models of in vitro spermatogenesis.</a> Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).</li>
<li>Zizzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+indicator+of+nonviral+transient+transfection+efficiency+in+endometrial+and+testicular+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies.</a> Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).</li>
<li>Williams, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+foreign+genes+into+tissues+of+living+mice+by+DNA-coated+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).</li>
<li>Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((statistics%2C+and+energetics+of+lipid+membrane+electroporation+studied+by+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations.</a> Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rodent+surgery+for+the+new+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of rodent surgery for the new surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), (2011).</li>
<li>Brinster, R. L., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+of+donor+haplotype+following+spermatogonial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).</li>
<li>Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+germ+cell+transplantation%3A+an+experimental+approach+with+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective.</a> Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), (2007).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), (2011).</li>
<li>Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+developing+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of developing mouse retina.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li>
<li>Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporated+transgene-rescued+spermatogenesis+in+infertile+mutant+mice+with+a+sertoli+cell+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect.</a> Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).</li>
<li>Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrase+facilitates+long-lasting+foreign+gene+expression+in+vivo+in+mouse+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells.</a> J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).</li>
<li>Umemoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+mouse+testes+by+electroporation+and+its+influence+on+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis.</a> J. Androl. 26, 264-271 (2005).</li>
<li>Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+gene+expression+in+the+mouse+testis+by+localized+in+vivo+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).</li>
<li>Hibbitt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+by+electroporation+allows+expression+of+a+fluorescent+transgene+in+hamster+testis+and+epididymal+sperm+and+has+no+adverse+effects+upon+testicular+integrity+or+sperm+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality.</a> Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).</li>
<li>Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+to+mouse+spermatogenic+cells+using+green+fluorescent+protein+as+a%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a.</a> J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).</li>
<li>Dhup, S., Majumdar, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+via+permanent+integration+of+genes+in+repopulating+spermatogonial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+transfection+of+testicular+germ+cells+and+transgenesis+by+using+the+mitochondrially+localized+jellyfish+fluorescent+protein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene.</a> FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).</li>
<li>Majumdar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+generation+of+transgenic+animals+to+evaluate+testis+genes+during+sexual+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation.</a> J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).</li>
<li>Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+expansion+of+germinal+stem+cells+by+ectopically+expressed+human+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+in+mouse+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells.</a> Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).</li>
<li>Ike, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+analysis+of+the+mouse+ornithine+decarboxylase+antizyme+haploid-specific+promoter+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation.</a> FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).</li>
<li>Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+RNAi+in+mouse+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29(2008).</li>
<li>Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+murine+lactate+dehydrogenase+C+%28Ldhc%29+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression.</a> Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).</li>
<li>Yomgogida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+testis%3A+a+target+of+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Mammalian testis: a target of in vivo electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).</li>
<li>Hayes, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Evaluation+of+Analgesic+Regimens+for+Abdominal+Surgery+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).</li>
</ol>

Sansar Michaelis, Alexander Sobczak ve Joachim M. Weitzel&#39;in, Üreme Biyoloji Enstitüsü, Çiftlik Hayvanı Biyoloji Leibniz Enstitüsü (FBN), Dummerstorf Almanya&#39;yı istihdam hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Özellikle erkek infertilitesi ve kaçınılmaz spermatogenez alanında üreme biyolojisi alanında, araştırma canlı organizmalar üzerinde dayanır. Testis işlevini incelemek amacıyla, yeterli hücre kültürü / in vitro bir sistem haploid olgun sperm 1,2 diploid spermatogonyum tüm önemli morfolojik değişiklikler yansıtma kapasitesine kurulmuştur. Böylece, genetik olarak değiştirilmiş hayvanların üretimi genellikle gereklidir ve erkek üreme biyolojisi böyle değerli bir araç olarak bir olduğunu....

Memeli spermatogenez olgun haploid sperm içine geliştirmek amacıyla art arda mitoz, mayoz ve farklılaşma geçiren kendini yenileyen kök hücrelerin karmaşık bir süreç olarak kabul edilir. Bu morfolojik değişiklikler, farklı hücre tipleri tarafından orkestra ve derin girişimlerine rağmen, hücre kültürü 1,2 bu süreçleri taklit hala imkansız. Dolayısıyla, bugüne kadar spermatogenez üzerine araştırmalar in vivo model olarak yaşayan organizmalar dayanır. Genel olarak, gen fonksiyonu çalışmalar, genellikle transgenik hayvanlarda dayanmaktadır. Bununla birlikte, üretme ve hayvan modellerinde bu tür sürdürülmesi zaman alıcı ve maliyet-yoğun ve oldukça karmaşıktır. Bu üreten ve nesiller boyunca transgen korumak için gerekli uzun yetiştirme süreci atfedilir. Buna ek olarak, transgenik ya da nakavt yaklaşım bütün organizmanın genetik manipülasyon g hedeflerken fizyolojik bozulmalara neden eğilimliÖrneğin birden fazla bölgelerde, temel işlevleri, testis dışında veya sistemik ile enes. Bundan başka, bazı geçiş transfeksiyon yöntemleri bazı önemli dezavantajlar ile ilişkilidir. Lipofeksiyon 3 ve mikro-parçacık bombardımanı 4 dokuya zarar verebilir ve yeterli transfeksiyon verimi açısından belirli bir hücre derinliği ile sınırlıdır, oysa Örneğin, virüs aracılı gen transferi tipik dezavantajları, immün reaksiyonlar ve ilave güvenlik düzenlemelerinin olası provokasyon bulunmaktadır. Buna karşılık, geçici nakiller başka bir ortak yolu olarak elektroporasyon (AP), in vivo nakil ve tutarlı in vivo gen analizi etkinleştirmek için umut verici bir teknik teşkil görünüyor. Genel olarak, AP nanosaniye olan sonuç olarak aracılı gözenek ile yerel zar gerilimine bağlı olarak dinamik bir olgu olarak adlandırılır. Bu boşluklar milisaniye boyunca muhafaza edilebilir, yeterli To DNA, RNA veya küçük moleküllerin 5 erişim izni. Uygulanan gerilim çok yüksek olduğunda, EP genellikle geçici karakteri nedeniyle ısı üretimi ve hücre 5 sonuçta geri dönüşümsüz hasar ile çok kapsamlı geçirgenleştirmeden indüksiyonu ile karşılaşmaktadır. Burada, elektroporasyon in vivo gen testis özelliklerinin ortaya konması için genetik dönüşümü için uygulanan testis olma yeteneğine sahip bir etkin ve ekonomik bir transfeksiyon sistemi olduğunu göstermektedir. Bu makalede, götürücü kanal ve fare testis sonra elektroporasyon ile bir plazmid hazırlama işlemi, mikro-enjeksiyon giderir. Bu prosedür, spermatogenez işlemlerini incelemek için in vivo fare testis seminifer tüp hızlı, spesifik ve verimli transfeksiyona elde etmek için tercih edilen bir araç olabilir.

<table><tbody><tr><td>Santrifüj</td><td>Sigma</td><td>1-15 PK</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>dikey kılcal çektirme</td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon kılcal damarları</td><td>Clark</td><td>GC100-10</td><td>borosilikat standart duvar</td></tr><tr><td>Mikropipet beveler</td><td>Bachofer</td><td>Typ 462</td><td>döner disk beveler</td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>Nepagene</td><td>CUY 21EDIT</td><td>kare dalga elektroporatör</td></tr><tr><td>Cımbız elektrotları</td><td>Nepagene</td><td>CUY 650P5</td><td>5 mm & Oslash; disk elektrotlar</td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Soğuk ışık kaynağı</td><td>Zeiss</td><td>KL 1500LCD</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon pompası</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>ev yapımı</td><td></td><td>XYZ çapraz masa</td></tr><tr><td>Cerrahi aletler</td><td>FST</td><td></td><td>makas, forseps, iğne tutucu</td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>FST</td><td>Dumont #5, #7</td><td>efferent kanal hazırlama</td></tr><tr><td>Michel klips uygulama zımba</td><td>FST</td><td>Michel, 12029-12</td><td></td></tr><tr><td>Michel dikiş klipsleri</td><td>FST</td><td>Michel, 12040-01</td><td>7,5 x 1,75 mm</td></tr><tr><td>Cerrahi sütür</td><td>Catgut, Markneukirchen, Almanya</td><td>Catgut 00</td><td></td></tr><tr><td>30 G iğneli şırınga</td><td>B. Braun</td><td>Omnican 40</td><td>mikropipet yüklemek ve anestezi için</td></tr><tr><td>Plazmid izolasyon kiti</td><td>Promega</td><td>Cat. # A2495</td><td>plazmit Midiprep</td></tr><tr><td>Plazmid pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>Cat. # 6084-1</td><td>CMV promotörü + EGFP</td></tr><tr><td>Plazmid pDsRed2-N1</td><td>Clontech</td><td>Kat. # 6084-1</td><td>CMV promotörü + DsRed2</td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil boya</td><td>Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>ddH 2 O</td></tr> % <tr><td>10 Ketamin</td><td>Serumu Werk, Bernburg, Almanya</td><td>Urotamin</td>,% <td>2 ksilazin ile 1: 1 oranında karıştırın</td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Serumu Werk, Bernburg, Almanya</td><td>Ksilazin</td>, ketamin Sterilium Bode Chemie <td>ile 1: 1 oranında ksilazin karışımı</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Sterillium</td><td>dezenfeksiyonu</td></tr><tr><td>Veteriner merhemi</td><td>S & K Pharma, GmbH</td><td>Kerato Biciron %5, göz kuruluğunu önlemek için Augensalbe</td><td>oftalmik merhem</td></tr><tr><td>To-Pro-3 iyodür</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">10x PBS, pH 7.4</güçlü></td></tr><tr><td>1.37 M NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofen, Dolormin</td><td>Johnson & Johnson Tüketici Sağlığı Hizmetleri Almanya</td><td>01094902</td><td>ameliyat sonrası ağrı kesici için analjezik pediatrik çözüm (NSAID)</td></tr><tr><td>27 mM KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>T106.2</td><td></td></tr><tr><td>18 mM KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr></tbody></table>

fare testis İn vivo mikroenjeksiyon ve elektroporasyon

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

Bu video ve makale katkı mikroenjeksiyon ve in vivo fare testis elektroporasyon kapsamlı bir açıklamasını verir. Testis fare hücreleri için bu özel teknik transfeksiyon spermatogenez benzersiz süreçlerin çalışma sağlar. Aşağıdaki protokol, plazmid yapıları ile fare testis hücrelerin transfeksiyonu odaklanmaktadır. Özellikle, kırmızı flöresanlı proteinin (DsRed2) ifade yeşil flüoresan protein (EGFP) ve ayrıca pDsRed2-N1 vektör geliştirilmiş ifade eden raportör vektör pEGFP-C1, ikinci. Her iki raportör genler kodlanan insan sitomegalovirüs hemen erken promoteri (CMV) kontrolü altındaydı. Fare testislerinde gen transferini gerçekleştirmek için, raportör plasmid yapıları, canlı farelerde testis enjekte edilir. Bu amaçla, bir hayvan anestetize testis maruz kalmakta ve mikroenjeksiyon site hazırlanır. Bizim tercih yerienjeksiyon testis ve epididim arasında spermlerin anatomik taşıma rotası olarak sonuçta bağlı rete testis ile, efferent kanal olduğunu. Bu şekilde, mikro enjeksiyon sonrası seminifer tüp doldurma sayesinde mükemmel lekeli DNA çözeltilerinin kullanılması ile idare ve kontrol edilir. Onun renkli tübül yapısı ile testisin yeterli dolgu gözlemledikten sonra, organ elektropore edilmiştir. Bu testis hücrelere DNA solüsyonu aktarılmasını sağlar. Inkübasyon 3 gün sonra, testis çıkarılır ve transfeksiyon başarı gösteren, yeşil ve kırmızı floresans mikroskobu altında incelendi. Genellikle, bu protokol DNA- ya RNA- teslim için kullanılabilir için canlı fare testisi içine inşa (over) ifade veya in vivo gen fonksiyon analizinde kolaylaştırılması, genleri yıkmak. Ayrıca, raportör gen ya da putatif düzenlenmesinden çalışmak için uygundurTory elemanları. Böylece, elektroporasyon tekniğinin ana avantajları, alternatif tekniklerle karşılaştırıldığında Gerekli düşük çaba yanı sıra ılımlı teknik ekipman ve becerileri ile birlikte hızlı performans vardır.

Kullanıldığı olarak in vivo fare testis mikro-enjeksiyon ve elektroporasyon gerçekleştirmek için protokole uygun olarak, deneysel ortamda, sınai olarak imal edilmiş mikropipetler elde etmek mümkün olsa da. Şekil 1 'de gösterilmiş olduğu için, (Şekil 1A çekerek kendi pipetler oluşturmak için tercih edilen bir böylece) ve bizote (Şekil 1B) cam kapilerleri onlar bizim ihtiyaçlarını donatılmış. Mikro enjeksiyon ve elektroporasyon için donatım Şekil 1C'de</s...

Testis fare hücreleri için bir transfeksiyon tekniği Spermatogenezisin benzersiz süreçleri incelemek için bu makalede, in vivo mikroenjeksiyon ve fare testis Elektroporasvon açıklar. Sunulan protokol, elektroporasyon ile cam kılcal hazırlanması götürücü kanalı yoluyla mikro-enjeksiyon, ve transfeksiyon adımlar içerir.

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Bu prosedürün amacı, fare testisine genetik yapıların mikroenjeksiyonunu ve ardından InVivo elektroporasyonu gerçekleştirmektir. Bu, spermatogenez ve testis fonksiyonuna odaklanarak kapsamlı gen analizinin yapılmasına izin verir. Bu, önce doğrudan PrepU bezlerinin üzerinde bir abdominal kesi yoluyla testise erişim sağlanarak gerçekleştirilir.İkinci aşama ise testisin bağlı olduğu efferent kanalın damarı yağ dokusundan serbestleştirerek mikroenjeksiyona hazır hale getirilmesidir. Daha sonra, KBB kanalı yüklü bir mikroenjeksiyon pipeti ile delinir ve leke genetik yapı solüsyonu testiküler feröz tübüllere uygulanır. Son adım, testisin çok taraflı elektroporasyon transfeksiyonudur.Sonuç olarak, transfekte edilen testis, kullanılan rapor edilen gen yapılarına bağlı olarak floresan mikroskobu veya luminometre ölçümleri ile transfeksiyonu değerlendirmek için üç gün sonra çıkarılır. Geçici bir transfeksiyon yöntemi olarak fare testisi için mikroenjeksiyon akıl operasyon tekniğinin bu kombinasyonu, transgenik hayvanlar veya nakavt fareler gibi mevcut yaklaşımlara göre kesinlikle birçok avantaj sağlayacaktır. Hızlı bir performans, düşük maliyet ve sadece orta düzeyde teknik becerilere ihtiya

in-vivo-microinjection-and-electroporation-of-mouse-testis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Biz elektroporasyon ve floresan mikroskobu kullanarak protein ekspresyonu sonraki görselleştirme kullanılarak canlı farelerin ayak kaslarının lifleri plazmid DNA verimli transfeksiyon ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır.

Memeli İskelet Kaslar kullanarak DNA Transfeksiyon In Vivo Elektroporasyon

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir...

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Fare iç kulak olan gelişim programı gebelikte özenli bir taslakları kaynaklı duyu organıdır. Biz bir...

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

Midgestation Fare Embryolarının Alt Rombik Dudak in vitro Elektroporasyon yılında

Biz'DNA plazmid dır fare mesane vivo içinde İdrar Kateterizasyon ve elektroporasyon ürotelyal hücre içine bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Kesesi hastalıkları otokton fare modelleri oluşturmak için hızlı ve kolay bir yol sunar.

Plazmid DNA teslimat için fare mesane Urothelium elektroporasyon tarafından roman yöntemi

Burada, inulin-FITC testis enjekte edilerek kan-testis bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu genetik ve çevresel öğeleri tarafından tehlikeye girebilir kan-testis bariyer bütünlüğünü incelemek için bir verimli vivo içinde yöntemidir.

Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi

Bu makalede, erkek mayotik bölünmesi için değerli bir model olan abdominal cerrahi ve testiküler GSK923295 enjeksiyonu yoluyla CENP-E'nin in vivo inhibisyonu bildirilmiştir. İmmünofloresan, akım sitometrisi ve transmisyon elektron mikroskobu tahlillerini kullanarak, CENP-E inhibisyonunun fare spermatositlerinde kromozom yanlış hizalaması ve genom instabilitesi ile sonuçlandığını gösterdik.

Kinesin-7 CENP-E'nin In Vivo İnhibisyon, İmmünofloresan ve Akım Sitometrisi Kullanılarak Spermatositlerde Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Bu protokol, fare yumurtalık kanalında bölgesel olarak kısıtlanmış CRISPR aracılı genom düzenlemesi için mikroenjeksiyon ve in vivo elektroporasyonu tanımlar.

In Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon Kullanan Somatik Genom Mühendisliği Fare Modelleri

Öğrenin fare testisinde mikroenjeksiyon ve elektroporasyon ile gen transferi yöntemini. Bu teknik spermatogenez ve testis fonksiyonlarını in vivo araştırmak için hızlı ve düşük maliyetli bir çözüm sunar.

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

Daha fazla video keşfet