Diseksiyon, Görüntüleme ve Farmakolojik Tedavi: Drosophila Pupa Testis ve Bekar Erkek germ-line Kistler ex vivo Kültür

Bu prosedürün genel amacı, post miyotik analiz etmek için canlı görüntüleme çalışmaları ve inhibitör tedavileri gerçekleştirmek üzere drosophila, pupil testisler ve germline kistinin ex vivo kültürlerini hazırlamaktır Miyogenez için bu, purium oluşumundan 24 saat sonra erken puy'dan itibaren sağlam testislerin ilk olarak diseksiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, bu testislerden tek germ hattı kistlerinin diseke edilmesidir, daha sonra sağlam testisler ve tek germ hattı kistleri canlı görüntüleme deneyleri için kullanılabilir. Alternatif olarak, bir sonraki adım, sağlam testisleri veya germ hattı kistini inhibitör bileşiklerle inkübe etmektir.

Sonuç olarak, tedavinin etkisini izlemek için kabak, testisler ve floresan mikroskobunun immün boyaması kullanılır. Bu ex vivo kültür tekniğinin mevcut genetik yöntemlere göre en büyük avantajı, post miyotik aşamalarda dilo spermatogeneze erişime izin vermesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, bazı deneyimlerin göz bebeği dokularını incelemek ve işlemek için gerekli olması nedeniyle mücadele eder.

Deneye başlamak için, 80 mikrolitre kalkan damlaları ve fetal sığır serumu ve antibiyotiklerle San M üç böcek ortamını 10 santimetrelik bir petri kabına dağıtın. Daha sonra, geniş bir forseps çifti kullanarak, bir pupa seçin ve tabağın üzerindeki bir damla orta seviyeye aktarın. Daha sonra malzemeleri fiber optik aydınlatıcı ile donatılmış bir stereo mikroskoba aktarın.

Beş numaralı forseps kullanarak diseksiyon sırasında testisleri oda sıcaklığının üzerinde ısıtmamaya dikkat edin. Pupa'yı en arka ucundan tutun ve yerinde tutun. Ön küreleri başka bir forseps çifti ile tutun ve öğrenciye ön ucunda bir perma açın.

Göğüs kafesinin en azından bir kısmı açığa çıkana kadar göz bebeği kılıfını soyun. Pupayı en arka ucundan yerinde tutmaya devam edin ve bir çift forsepsin her iki kolunu da pupa'nın baş bölgesine sokarak pupa'nın iç basıncını serbest bırakın. Daha sonra, forsepsleri açarak ve forsepsleri ön yönde hareket ettirerek pupayı yırtın ve ilk denemede açıklığın mümkün olduğunca büyük olduğundan emin olun.

Basınç serbest bırakılmadan önce pupaya arka ucundan zarar vermekten kaçının. Çünkü bu, testislerin doğrudan küçük açıklıktan itilmesine ve hasar görmesine neden olabilir. Pupa açıldıktan sonra, pupa'nın serbest bırakılan iç basıncı, büyük açıklıktan yağ vücut hücrelerinin ve dokuların glomerasını dışarı iter.

Daha sonra bir çift forseps kullanarak açıklığın boyutunu artırın ve testislere zarar verebileceği için pupayı forseps ile sıkmaktan kaçının. Ardından, pupayı en arka ucundan yakın tutun. Diğer forseps çifti ve testisleri pupadan serbest bırakmak için pupanın içeriğini arkadan öne doğru nazikçe çizer.

Öğrenci testislerinin dışarı itilip itilmediğini kontrol edin. Başka bir dokuya bağlı olmayacaklar. 24 saat sonra A PF, testisleri önceden kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet ucu ile toplar.

Testislerle taşınan yağ vücut hücrelerinin sayısını azaltmak için ortamın sadece küçük bir miktarını aktarın. Daha sonra testisleri taze bir kültür kabına orta ortama yerleştirin. Canlı görüntüleme için sadece birkaç yağ vücut hücresi kalana kadar testisleri birkaç kez orta ile yıkayın.

Testisleri besiyeri olan bir cam tabanlı kültür kabına aktarın ve diseksiyona başlamak için ters çevrilmiş bir görüntüleme mikroskobu kullanın. Bir veya daha fazla pupil testisini besiyeri ile doldurulmuş bir cam tabanlı kültür kabına aktarın. Erkek germ hattı kistlerinin diseksiyonu için fiber optik aydınlatmalı bir stereo mikroskop ve iki paslanmaz çelik iğne kullanın.

Bir iğne dikkatlice tutturulurken, bir testis ön veya arka ucunda ve yerinde tutun. Diğer iğneyi testis içine sokun ve iğneyi yana doğru hareket ettirerek testis kılıfını bozun, bu da kistlerin çoğunu serbest bırakacaktır. Bir iğne ile testisi yerinde tutmaya devam edin.

Daha sonra testisten kalan kistleri nazikçe çıkarmak için diğer iğneyi kullanın. Sonraki ayrı kümelenmiş kistler. 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, kistleri orta dereceli taze bir kültür kabına aktararak.

Daha sonra, tek kistlerin canlı görüntülenmesi için kültürlenmiş kabı ters çevrilmiş bir görüntüleme mikroskobuna taşıyın. Gerekirse kistleri bir iğne ile tekrar dağıtın, faz kontrastı ve floresan mikroskobu kullanarak kistlerin evresini belirleyin. İstenilen aşamadaki bir kiste odaklanın.

Kistin odağını ve konumunu sık sık onaylayın. Daha uzun görüntüleme deneyleri sırasında, kistler kültür kabının dibine yapışmaz. Odak dışına çıkmaya niyet edin.

24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının her bir oyuğunu, 12 tekrarlı bir deney için 500 mikrolitre ortamla doldurun. Daha sonra önceden kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak her bir oyuğa bir öğrenci testisi aktarın. Daha sonra, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak izole testislerde protamin varlığını kontrol edin.

Testisler protamin içermemelidir, B-E-G-F-P sinyali, bu da hisondan protamine veya HP anahtarının hiçbir kistte yer almadığını gösterir. Zaten pozitif kistler gösteren testisleri değiştirin. İlk 12 kuyucuğun her birine bir mililitrede 150 mikromolar nihai konsantrasyona ulaşmak için inhibe edici bileşik olan endo karik asit içeren 500 mikrolitre ortam ekleyin.

Solvent ile 500 mikrolitre ortam ekleyerek kalan kuyucukları arıtılmamış kontroller olarak kullanın. Daha sonra plakayı karanlıkta 24 saat boyunca beş santigrat derecede inkübe edin. İnkübe edilmiş testislerde protamin varlığını tekrar kontrol edin.

Kontrol testisleri şimdi bir veya daha fazla protamin, B-E-G-F-P pozitif kist göstermelidir, bu da HP anahtarından bir geçişi gösterir. Daha sonra, 200 mikrolitre uçlu bir pipet kullanarak, testisleri poli L lizin kaplı slaytlara aktarın. Kabak hazırlıkları yapın ve floresan antikorlarla boyayın.

Yayınlanan protokollerin ardından, bu diseksiyon yöntemi kullanılarak drosophila testislerinin faz kontrast görüntüleri elde edildi. Bu, bir drosophila pupa'nın hafifçe ezilmiş bütün bir testisidir. PY oluşumundan veya PF PF'den 24 saat sonra, spermatogonia hub bölgesinin altındaki ön uçla sınırlıdır.

Kalan testis, Nevin akım evresinde yuvarlak çekirdekli spermatidler ve faz kontrastlı büyüyen flagella kaplamaları ile uzama evrelerinde spermatidlerle doldurulur, 24 saatlik A PF'de H, iki A-V-D-R-F-P ve protamin B-E-G-F-P'yi saptamak için eve monte öğrenci testislerinden EGFP ve RFP floresan görüntüleri elde edildi. Spermatidlerin hiçbiri sık sık HP geçişine tabi tutulmamıştır. Bu aşamada diseke edilen testisler bir otofloresan yapı içerir. Bir pupil testis 36 saat sonra diseke edilir, A PF ilk protamin olan B-E-G-F-P pozitif kisti gösterir.

Öğrenci testisleri 48 saat A PF'de görünür protamin pozitif çekirdekleri olan birkaç germline kisti vardır. Kültürde gelişen tüm testislerin hızlandırılmış ex vivo canlı görüntüleri kaydedilebilir. Bu yöntem kullanılarak, bir öğrenci testis 45 saat diseke edildi, A PF altı saat boyunca besiyerinde inkübe edildi ve her beş dakikada bir görüntülendi.

Bu zaman dilimi içinde, HP anahtar aşamasından birkaç spermatid kisti ortaya çıkar ve parlak bir protamin B-E-G-F-P sinyali gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, in vivo görüntüleme veya inhibitör tedavileri gerçekleştirmek için erken pupil testis ve tek germ hattı kistinin kültürde nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.