İnsan Hücre Lines Kemorezistans Yumurtalık Kanser Kök Hücreleri Zenginleştirme

Kanser kök hücreleri (rulmanları) nedeniyle kemoterapi direncinin tümör nüks sorumlu tutulmaktadır. Biz seçimi ve yumurtalık kanseri hücre hatları CSCS genişlemesi için bir protokol optimize ettik. Kemoterapötik Sisplatin ile hücrelerin tedavisi ve biz yapışmayan CSC kültürler için zenginleştirmek medyayı teşvik kök hücre kültürleme tarafından.

Bu prosedürün genel amacı, kemoterapiye dirençli yumurtalık kanseri kök hücrelerini veya CSC'leri seçmek ve izole etmektir. Bu, ilk olarak yumurtalık kanseri hücre hatlarının kırmızı floresan proteini veya RFP ile floresan olarak etiketlenmesi ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralaması veya gerçekleri kullanılarak RFP pozitif hücrelerin seçilmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, yumurtalık kanseri hücre hatlarını 72 saat boyunca kemoterapötik sisplatin ile tedavi etmek ve daha sonra hayatta kalan hücreleri CSC ortamında kültürlemektir.

İki gün sonra, uyumsuz steroidler oluşacaktır. Daha sonra, CSC'ler kök hücre belirteçleri için gen ekspresyon analizi kullanılarak karakterize edilir ve CSC'ler akış sitometrisi kullanılarak hücre yüzeyi belirteçleri için analiz edilir. Sonuç olarak, terapötik yanıt için CSC'lerin analizi, hücrelerin sisplatin veya paklitaksel ile muamele edilmesi ve canlılığı ölçmek için bir MTT testi yapılmasıyla elde edilir.

Bu tekniğin, kanser hücrelerini yüksek dozda paklitaksel ve sisplatin ile tedavi etmek gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yöntemimizin daha az toksik miktarda kemoterapötik ajan kullanırken daha canlı hücreler vermesidir. Bu tekniğin etkileri, yumurtalık kanserinin tedavisinin iyileştirilmesine kadar uzanır, çünkü CSC'ler yeni tedavi modalitelerine ihtiyaç duyacak terapötik olarak dirençli bir popülasyonu temsil eder. Bu yöntem aynı zamanda pankreas kanseri, meme kanseri gibi diğer sistemlere ve tedaviye dirençli hücrelere sahip diğer tümör türlerine de uygulanabilir.

Jennifer ile birlikte bu tekniği gösteren, laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Dr.Leroy olacak. Başlamak için, Skov üç ve O öksürük 4, 2, 9 hücre hatlarını, 37 santigrat derecede 37 derecede %5 CO2 ile çoğaltın ve hücreleri %40 ila %50 co akıcılığına kadar büyütün. SCV oluşturmak için, kırmızı floresan proteini veya RFP eksprese eden üç hücre, 72 saat boyunca penisilin ve streptomisin yokluğunda SCV üç ortamına RFP ve mililitre poli beyin başına 10 mikrogram eksprese eden lentiviral partiküller ekleyin.

72 saat sonra, floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması ile RFP pozitif hücreleri seçin veya önce tripsin RFP ve RFP eksprese etmeyen hücreler ile gerçekleri seçin, ardından santrifüjlemeyi takiben beş dakika boyunca 125 kez G'de santrifüjleyin, hücreleri bir hücre sıralayıcıda% 0.1 BSA içeren PBS'de mililitre başına 10 milyon hücrede yeniden süspanse edin. Sıralama parametrelerini belirlemek için RFP olmayan hücreleri kullanın. Daha sonra, kanser kök hücrelerini zenginleştirmek için 561 nanometre lazer kullanarak yüksek RFP ifade eden hücreleri toplayın.

SCV üç, SCV üç RFP veya O öksürük 4 2 9 hücre hattını 72 saat boyunca 20 mikromolar kemoterapötik sisplatin ile tedavi edin. Bir sonraki tripsin, CSC ortamındaki hücreler ve kültürdür. Hücreleri beş dakika boyunca 125 kez G'de santrifüjleyerek ortamı iki günde bir değiştirin ve Resus, hücreleri sayarak ve trian mavisi dışlama gerçekleştirerek her iki günde bir peleti taze CSC ortamında askıya alarak hücreleri canlılık açısından kontrol edin.

Daha önce olduğu gibi santrifüjleyerek ve peleti uygun çözelti içinde tekrar askıya alarak daha ileri deneyler için CSC'leri toplayın. 20 x ve 40 x büyütmelerde bir ışık mikroskobu kullanarak CSC hücre morfolojisini izler. İlk önce CSC'leri karakterize etmek için, hücreleri içeren ortamı beş dakika boyunca 125 kez G'de santrifüjleyerek üç CSC preparatı toplayın.

Daha sonra peleti gu indiyum tiyosiyanat içeren bir fenol çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. RNA ekstraksiyonu için, daha sonra ticari olarak temin edilebilen bir CDNA ters transkripsiyon kiti kullanarak 0.1 ila bir mikrogram RNA arasında tamamlayıcı DNA veya CD NA sentezleyin. Ardından, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Q-R-T-P-C olarak kısaltılan kantitatif ters transkripsiyonlu polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirin.

Birden fazla floroforu tespit edebilen gerçek zamanlı bir PCR termodöngüleyici kullanarak her numune için tüm Q-R-T-P-C-R'yi çift olarak gerçekleştirin. Son adım olarak, her numune için kök hücre gen ekspresyonunu DH ekspresyonunu boşa alacak şekilde normalleştirin. Delta delta CT yönteminin kullanılması.

Hücre içeren ortamları toplayarak ve beş dakika boyunca 125 kez G'de santrifüjleyerek CSC'leri hasat edin. Hücre ayırma çözeltisini çıkarmak için tekrar santrifüjlemeden önce hücreleri parçalamak için 500 mikrolitre proteolitik olmayan bir hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Sonra hücreleri iki kez soğuk PBS ile yıkayın.

Hücreleri döndürdükten sonra hücreleri etiketlemeden önce bir saat boyunca normal büyüme ortamında inkübe edin. Daha önce olduğu gibi, PBS'deki hücreleri anti CD 1 33 PE ve anti CD one 17 FE içeren% 0.1 BSA ile yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri gece boyunca% 1 Para formaldehitte sabitleyin, CD one 17 ve CD 1 33 hücre yüzey ifadesini analiz etmek için akış sitometrisi yapın. FL bir ve FL üç kanalındaki hücreler hakkında veri toplayın ve hem E hem de pe harflerini ifade eden hücreler için kapılar oluşturun.

Dört kadranlı bir nokta grafiği oluşturun ve her kadran plakasındaki hücre sayısını belirleyin. Gece boyunca 96 oyuklu plakada her hücre varyantı için oyuk başına 5.000 hücre. Daha sonra hücreleri 96 saat boyunca çeşitli konsantrasyonlarda sisplatin veya paklitaksel ile tedavi edin.

96 saat sonra, mililitre başına 10 mikrolitre 10 miligram ekleyin. MTT, çökelti çözünmek için oluşana kadar iki ila dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilir. MTT. Dört milimolar hidroklorik asit ve% 0.1 NP 40 içeren bir çözelti olan MTT çözücüsünü İzopropanol içinde ekleyin.

Karanlıkta 15 dakika inkübasyonun ardından, CSC'lerin sisplatin tedavisi kullanılarak epitelyal yumurtalık kanseri hücre hatlarından izole edildiğini göstermek için bir plaka okuyucuda 570 nanometrede plakaları okuyun. Hücre hatlarının görüntüleri tedaviden önce elde edildi ve seçimden sonra ışık mikroskobu aderans görüntülerini yakaladı. SCV üç ve OCA 4 2 9 hücrelerinin yanı sıra SCV üç CSC ve OCA 4 2 9 CSC CSC'leri yuvarlak görünür ve doku kültürü plakalarına yapışmaz.

RFP ile transdüksiyona uğrayan SCV üç hücresi, CSC'lerin izolasyonundan sonra floresanlarını korur ve hücrelerin canlı olduğunu gösterir. Uygun. CSC kültürleri ilaç tedavisine yanıtları açısından değerlendirildi. CSC'ler, kök hücre genlerinin sisplatin ve paklitaksel ekspresyonuna karşı artmış direnç göstermiştir.

CD 1 33 NEIN nano ve T four incelendi. İlk deneylerde. T dört nano ve nein, S SCV üç CSC kültüründe tedavi edilmeyenlere kıyasla daha yüksekti, ancak sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı değildi.

CD 1 33, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla SCV üç CSC kültüründe önemli ölçüde indüklendi. Bu deneyler tekrarlandıktan sonra, ebeveyn kontrol hücrelerine kıyasla S SCV üç CSC'de T dört ve nano artmıştır. SCV üç, CSC'ler, faks analizi ile ortaya çıktığı gibi, CSC işaretleyicisi CD bir 17'nin artan hücre yüzeyi ekspresyonunu sergiler Bu prosedürü denerken, bu protokolün en büyük sınırlamasının CSC'nin canlı kaldığı sürenin uzunluğu olduğunu hatırlamak önemlidir.

Bu protokolü kullanarak, CSC bir haftadan daha kısa bir süre boyunca uygulanabilir kalır. Bu nedenle, CSC'ler için deney ve analiz türlerinin dikkatli bir şekilde zamanlanması gerekir. Sisplatin ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve koruyucu giysi kullanımı ve cilt ve mukus zarlarıyla temastan kaçınma gibi önlemlerin her zaman bu prosedürü takiben alınması gerektiğini unutmayın.

Hücrenin canlılığı ile ilgili ek soruları yanıtlamak için triam mavisi dışlaması gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir, ayrıca CSC'lerin gelişiminden sonra tümörü teşvik edici özelliklerini göstermek için seyreltme testlerini sınırlayabilir. Bu teknik, kanser alanındaki araştırmacıların kemoterapi direncine yol açan yolları keşfetmelerinin yolunu açtı.