Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Kanser tümörü çevreleyen dokunun hem de yerel pro- ve anti-inflamatuar aracılar tarafından etkilenir kompleks bir hastalıktır. Bu nedenle, daha çok deri altı modellere göre ortotrop enjeksiyon modelleri, bir şekilde daha iyi taklit eden insan patoloji kanser ilerlemesinin incelemek için yararlı olabilir.

Bu prosedürün genel amacı, fare bellek yağ pedinde tümör hücresi engraftasyonundan sonra meme hücresi ilerlemesini araştırmaktır. Bu, meme kanseri hücrelerinin yetişkin bir farenin hafıza yağ pedine enjekte edilmesi ve ardından tümör hacminin önceden belirlenmiş zaman seviyelerinde bir kumpas ile ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Deneyin sonunda, tümör kütlesi ve hacmi belirlendi ve daha ileri analizler için hayvanın kanı ve akciğerleri alındı.

Sonuç olarak, makro ve mikro metastazlar sırasıyla görsel ve immünohistokimyasal analizlerle ölçülebilir. Bu tekniğin deri altı tümör hücresi enjeksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, meme yağ yastığı enjeksiyon bölgesinin orijinal meme tümörü oluşum bölgesini taklit etmesi ve daha güvenilir sonuçlar vermesidir. Bu yöntem, meme kanseri alanındaki hangi tümörün, baskılayıcıların, onkogenlerin veya stromal kompartman bileşenlerinin kanserin ilerlemesinde rol oynadığı gibi önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

İşlemden bir gün önce, N-O-D-S-C-I-D gama farelerini dördüncü meme ucundan orta hatta kadar tıraş edin ve tüm hayvanların kabaca karşılaştırılabilir ağırlıklara sahip olduğunu doğrulamak için tartın. Ertesi gün, bir insan meme adenokarsinomu hücre kültürünü PBS ile bir kez yıkayın ve ardından hücrelerin çoğu ayrıldığında hücreleri anize edin. Reaksiyonu DMEM ortamı içeren 10 mililitre serum ile söndürün ve daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 1.200 RPM'de yedi dakika boyunca döndürün, serum kalıntılarını gidermek için peleti yıkayın ve ardından ikinci peleti PBS'de yeniden süspanse edin.

Saydıktan sonra, hücreleri 150 mikrolitre konsantrasyonda 500.000 adet olarak buz üzerindeki steril mikro santrifüj tüplerine ayırın. Daha sonra bir 50 mililitrelik konik tüpü 35 mililitre PBS ve diğerini %70 etanol ile doldurun ve her birine pamuklu çubuklarla batırın. Her hayvan için tüm aletler hazır olduğunda, hayvanın gözlerine oftalmik merhem sürün.

Ardından, anestezi faresini bir ısıtma yastığı üzerinde nazikçe tutmak için bant kullanın ve ayak parmağınızı sıkıştırarak sedasyonu onaylayın. Tıraşlı alanı temizlemek için etanole batırılmış bir pamuklu çubuk kullanın ve ardından dördüncü meme ucu ile orta hat arasında küçük bir kesi yapmak için bir neşter bıçağı kullanın. Bir cep yapmak için PBS ıslatılmış pamuklu çubuğu insizyona yerleştirin ve ardından beyaz rengiyle algılanabilen bir hafızalı yağ pedini ortaya çıkarmak için cımbız kullanın.

Yağ pedini tabanından sıkmak ve dokuyu tamamen açığa çıkarmak için başka bir cımbız kullanın. Daha sonra homojen bir hücre çözeltisi elde etmek için adenokarsinom hücrelerini birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 150 mikrolitre hücreyi bir insülin şırıngasına nazikçe aspire edin. Bir şırıngayı iğne deliği yukarı bakacak şekilde yatay olarak tutmaya dikkat edin.

Hücreleri meme yağ yastığına enjekte edin ve dokunun şişmesiyle başarılı bir enjeksiyonu onaylayın. Daha sonra yağ pedini nazikçe serbest bırakın ve insizyonu dikmek için sivrisinek forsepslerini kullanın, sütürü sivrisinek forsepslerinin etrafında saat yönünde, saat yönünün tersine ve saat yönünde çevirerek üç düğüm yapın. Ameliyattan sonra, bir analjezik enjekte edin ve her hayvanı ayrı bir kafeste sternal yaslanmış bir pozisyona yerleştirin ve fareleri tamamen iyileşene kadar izleyin.

Hücre implantasyonundan sekiz hafta sonra, fareler organ toplama için hazırlanır. Hayvanı bir köpük tabanına sabitleyin ve tümör hacmini ölçmek için kaliperler kullanın. Ardından, uzun bir dikey orta hat kesisi yapın ve ardından ön bacağın hemen altında ve arka bacağın üzerinde iki yatay kesi yapın.

Tümörü ortaya çıkarmak için cildi köpüğe sabitleyin ve ardından tümörü ciltten ayırmak için makas kullanın. Daha sonra akciğerleri nazikçe çıkarın, sol akciğeri üç gün boyunca Bowen çözeltisine yerleştirin, daha sonra bu yüzeysel metastatik folky çıplak gözle açıkça görülebilir hale gelir, daha sonra RNA izolasyonu için dokunun bir kısmını sıvı nitrojen içinde dondurur ve tümörün kalan kısmını formin ile doldurulmuş konik tüplerden birine yerleştirin. Daha sonra, hayvanın kardiyak ponksiyon ile kurban edilmesinden sonra, 450 mikrolitre kan örneğini 50 mikrolitre% 3.2 sodyum sitrat içeren bir mikro santrifüj tüpüne dağıtın, daha sonra kırmızı kan hücrelerini döndürün ve plazma örneklerini negatif 20 santigrat derecede saklayın. Hücrelerin kesin olmayan bir şekilde aşılanması veya sızıntı gibi deneysel hatalar, tümör boyutunda değişikliklere veya hatta tümörün yokluğuna yol açabilir. hafızaya benzer görünen bir yapının oluşumu.

Kontrol tamponu ile enjekte edilen yağ tamponu. Tümörün büyüme hızı aynı zamanda enjekte edilen hücre hattının doğasına da bağlıdır ve genel olarak farenin derisi aracılığıyla gözlemlenebilir. Ek olarak, tümörün etrafındaki alan, vasküler yeniden şekillenmeden kaynaklanan ve atık ürünlerin uzaklaştırılmasında ve tümör dokusunun besin ve oksijen sağlamasında çok önemli roller oynayabilecek büyük damarlar gösterebilir.

İn vitro deneylerden farklı olarak, tümör hücrelerinin büyüme hızı, hipoksi ve besin eksikliği nedeniyle in vivo olarak zaman içinde sabit olmayabilir. Çevredeki dokuda nekrotik alanlar oluşabilir ve bu alanlar tümörün büyüme hızını etkileyecektir. Ek olarak, ilgilenilen belirli genleri ifade eden enjekte edilen hücreler, genler hızlı bir şekilde başlayan, ancak sonunda yavaşlayan veya tam tersi olan tümör büyümesini indükleyebileceğinden, kanserin ilerlemesini etkileyebilir.

Bowen'in solüsyonundaki akciğerlerin toplanması, akciğer dokusunun yüzeyinde kabarık soluk oluşumlar olarak görünen yüzeysel metastatik odakların görselleştirilmesine yardımcı olur. Odakların oluşumu hücre hattına bağlıdır. Agresif olmayan hücreler sadece mikro metastazlara yol açabilir, bu da parafine gömülü akciğer dokusunda h ve e boyaması ile kolayca tanımlanabilir.

Bu prosedürü takiben, deneysel tümörün büyümesinin plazmadaki sitokin veya proanjiyojenik moleküllerin seviyelerini nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için Eliza gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.