İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

Bu prosedürün genel amacı, insan mezenkimal kök hücrelerini gözenekli kemik matriksi üzerinde kültürlemektir. Bu, ilk olarak insan amniyotik membranından veya hcs'den mezenkimal kök hücrelerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, gözenekli kemik matris diskleri, hücrelerin büyümesi için besinlerin doğru dağılımını desteklemek üzere hazırlanır.

Daha sonra hcs, gözenekli kemik matris diskleri üzerinde kültürlenir. Son olarak, koloni oluşturan birimler sayılır ve morfoloji yapılır. Hücre proliferasyonu ve hücre yapışmasının tümü analiz edilir.

Sonuç olarak, hücresel morfoloji, koloni oluşturan birimlerin sayısı, hücre proliferasyonu ve hücre adezyonu sırasıyla vital boyalarla optik mikroskopi boyama ve taramalı elektron mikroskobu ile analiz edilir. Bu tekniğin etkileri, kemik yaralanmaları tedavimize kadar uzanır, çünkü mezenkimal kök hücreleri, doğal kemiği taklit eden makro gözenekli biyomateryallere vermek mümkündür. Mezenkimal kök hücreleri insan amniyotik zarından izole etmek için, göbek kordonunu bir elinizle tutun ve diğer elinizle yarı saydam bir tabaka gibi görünen amniyotik zarı çıkarın.

Numunede choon varsa, amniyon dokusundan ayırmak için manuel olarak inceleyin. Kalan kanı çıkarmak için numuneyi üç kez yıkamak için beş mililitre PBS kullanın ve kan pıhtılarını bir neşterle çıkarmak için basit forseps kullanın. Yaklaşık 0,5 santimetre karelik parçalar oluşturmak için amniyotik zarda küçük kesikler yapın.

Membranı sindirmek için, parçaları 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve beş mililitre% 0.125 tripsin 0.5 milimolar EDTA çözeltisi ekleyin. Beş dakika boyunca 200 Gs ve 25 santigrat derecede döndürmeden önce 37 derece ve %5 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin. Sonra süpernatanı atın.

Daha sonra, 15 mililitre kollajenaz tip iki çözelti ekleyin ve al lav protokolüne göre ara sıra çalkalayarak 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Sindirimden hemen sonra, 15 mililitre PBS ekleyin ve 200 Gs ve 25 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve tekrar 15 dakika döndürmeden önce hücre peletini yıkamak için PBS'yi kullanın.

Süpernatanı attıktan sonra, pelete 10 mililitre H-G-D-M-E-M ekleyin ve hafifçe çalkalayarak tekrar süspanse edin. Mezenkimal kök hücreleri genişletmek için. Bir kültür şişesine iki mililitre hücre süspansiyonu ekin ve iki mililitre H HG DMEM inkübe edin.

Ve beş ila yedi gün sonra, kültür ortamını değiştirerek yapışmayan hücreleri çıkarın. Daha sonra yedi ila 10 gün daha boyunca her üç günde bir, hücreler% 90 birleşene kadar kültür ortamını değiştirin. % 0.125 tripsin EDTA ekleyin ve hücre süspansiyonunu aspire etmeden ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmadan önce beş dakika inkübe edin.

Hücreleri döndürdükten ve süpernatanı attıktan sonra, hücre pelet kültürünü yeniden süspanse etmek için HG DMEM kullanın. 2 75 santimetrekarelik hücreler şişelenir ve kültürü% 90 birleşimde tutar. Dokuzuncu pasaja veya alt kültüre kadar izasyonu ve tekrar kaplamayı tekrarlayın.

Daha sonra akış sitometrisi veya diğer çalışmalar için hücreleri kurtarın. Gözenekli kemik matriks diskleri hazırlamak için. Her NKB diskine FBS'siz üç mililitre HG DMEM ekleyerek başlayın ve ertesi gün FAA etal'e göre gece boyunca nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin.

Her diski 50 mililitrelik bir konik tüpe yerleştirin ve fazla kültür ortamını çıkarmak için beş dakika boyunca 200 GS'de döndürün, ardından 24 oyuklu bir kültür plakasına aktarın. 500 mikrolitre H-G-D-M-E-M ekleyin ve besinlerin ve hücrelerin doğru dağılımını desteklemek için disklerde hava kabarcığı bulunmadığından emin olun. Üç alt kültürden 25 santigrat derecede 30 dakika boyunca yavaş ve sürekli olarak inkübe edin.

Evlilik öncesi biyomateryal diskin yüzeyine hücresel bir süspansiyon tohumlayın ve 30 dakika inkübe edin İnkübasyondan sonra, dikkatlice 1.5 mililitre savaş öncesi H-G-D-M-E-M ekleyin ve bir hücre proliferasyon testi yapmak için kültürü üç gün boyunca koruyun, üreticinin yönergelerine göre hücre diski örneklerine 150 mikrolitre hayati renklendirici AB ekleyin. 600 nanometre referans dalga boyu ile 570 nanometrede absorbansı hemen ölçün. Hücreleri yedi gün boyunca inkübe edin ve her 24 saatte bir absorbansı ölçün.

H-G-D-M-E-M'de 100 milimetre doku kültürü diski başına 100 hücre kültürleyerek koloni oluşturan birimleri ölçün ve 14 gün inkübe edin. Kültürü yıkamak için PBS kullanın ve hücreleri oda sıcaklığında beş ila 10 dakika lekelemek için metanolde %0.5 kristal menekşe kullanın. Bu akış sitometrisi histogramlarında görüldüğü gibi hücreleri saymak için mikroskop kullanmadan önce plakaları iki kez yıkamak için PBS kullanın.

Amniyotik membrandan izole edilen hücre popülasyonu, yüzey mezenkimal belirteçleri CD 90, CD 73 ve CD 1 0 5'e güçlü bir şekilde reaktifti ve hematopoietik belirteçler CD 34 ve CD 45'e negatif reaksiyon gösterdi, bu da HSC'lerin aslında mezenkimal olduğunu gösteriyor. Bu tarama mikrograflarında gösterildiği gibi, biyomateryalin yüzeyi birinci gün küresel hücrelerle kaplandı ve AMC'ler yedinci günde sığır matris yüzeyine görünüşte bağlandı. Daha yüksek büyütmede dolgu podal işlemleri ile hücreler birbirleriyle temas kurar.

Bu grafik, sığır matrisinin nispi absorbans birimlerinde küçük bir azalmayı göstermektedir. Bir günlük inkübasyondan sonra, iskelenin varlığı, kök hücreleri analiz etmek için koloni oluşturan birim testi kullanılarak sığır matrisinin yokluğunda gerçekleştirilen kültüre kıyasla istatistiksel olarak anlamlı olan hücre proliferasyonunda bir artışa neden olur. Bu grafik, bu videoda gösterildiği gibi izole edilen ve değişen yoğunluklarda kaplanan HSC'lerin, kültürde 14 günde ayrı koloniler oluşturma yeteneklerini koruduğunu göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, mezenkimal kök hücrelerin makro gözenekli biyomateryallere nasıl verileceğini iyi anlamış olmalısınız.