CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, genomik delesyonlar oluşturmak için CRISPR Cas dokuz nükleaz sistemini kullanmaktır. İlk elektro saflaştırma, iki CRISPR plazmidi ve bir GFP raportör plazmidi aynı anda hücrelere yerleştirir. Daha sonra floresanla aktive edilmiş hücre sıralamasını kullanarak, GFP eksprese eden hücrelerin ilk %3'ünü izole edin.

Daha sonra, sıralanmış hücreleri seyreltmeyi sınırlayarak plakalayın ve geleneksel PCR kullanarak biyo alelik delesyon klonlarını tarayın. Sonuç olarak, CRISPR Cas dokuz, fonksiyon kaybı delesyon alelleri üreterek genleri ve genetik elementleri incelemek için kullanılabilir Tek bir kılavuz RNA tarafından üretilen çerçeve kayması mutasyonlarıyla karşılaştırıldığında, CRISPR Cas dokuz nükleaz sistemi tarafından üretilen büyük delesyonlar, fonksiyon kaybı mutasyonlarının sağlanmasına yardımcı olabilir. Bu yaklaşım aynı zamanda geleneksel bir PCR yoluyla kolay ve ucuz taramaya izin verir.

Bu yöntem için ilk olarak, tek bir kılavuz RNA tarafından oluşturulan küçük indellerin taranmasının teknik olarak zorlu, zahmetli ve pahalı olduğunu bulduğumuzda aklımıza geldi. Delesyon alelleri de kaplama olmayan genetik elementlerin incelenmesi için özellikle bilgilendiricidir. Her CRISPR çifti peleti için, iki kez 10 ila altı hücre süspansiyon halinde büyütülür. Hücreleri 100 mikrolitre elektroporasyon çözeltisinde yeniden süspanse edin ve ardından bir elektroporasyon QAT'a aktarın.

Beş mikrogram CRISPR Cas dokuz, yapı SG RNAA, beş mikrogram CRISPR Cas dokuz ekleyin. GFP ekspresyonunun SG, a B ve 0.5 Mikrogramını oluşturun, karıştırmak için pipeti birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı yapın. Bir elektroporasyon sistemi kullanarak kabarcık üretmekten kaçının.

Hücreleri steril bir transfer pipeti ile iki milimetrelik bir damarda beş milisaniye boyunca 250 volt ile elektro saflaştırın, çözeltiyi hemen bir mililitre ön ısıtma kültür ortamına aktarın. Hücreleri 24 ila 72 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri steril 50 mikronluk bir filtreden bir faks tüpüne geçirin.

Ardından, yüksek düzeyde plazmit alan hücreleri zenginleştirmek için GFP pozitif hücrelerin ilk %3'ünü faksla sıralayın. İlgilenilen hücreler için sınırlayıcı seyreltme koşullarını optimize ettikten sonra, plaka, hücreleri 96 oyuklu bir plakaya ve oyuk başına 100 mikrolitre hücre kültürü ortamı ile plaka başına 30 hücrelik bir seyreltmeye ayırdı. Kalan sıralanmış yığın hücreler için, gelecekteki kaplama için hücrelerin yarısını dondurur.

Diğer yarısını tarama ve astar doğrulaması için plakalayın. Bu toplu hücreleri üç ila yedi gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Klonların, hücre hattının iki katına çıkma süresine bağlı olarak yedi ila 14 gün boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırılmasına izin verin.

Genomik DNA Resus'u izole etmek, ebeveyn ve toplu hücre peletlerini 50 mikrolitre DNA ekstraksiyon çözeltisinde askıya almak için kullanılır. Genomik DNA'yı çıkarmak için numuneyi bir termodöngüleyicide çalıştırın. Ardından DNA konsantrasyonunu ölçün.

Şimdi 10 mikrolitre iki XPCR karışımını birleştirerek 20 mikrolitrelik bir PCR reaksiyonu oluşturun. 0.5 mikrolitre 10 mikromolar ileri astar 0.5 mikrolitre 10 mikromolar ters astar, 50 ila 100 nanogram genomik DNA ve 20 mikrolitreye kadar su. Delesyon olmayan bant ve delesyon bandı için ayrı reaksiyonlarda PCR gerçekleştirin.

Daha sonra, numuneleri bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve ekteki yazılı protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi 60 santigrat derece A diz çökme sıcaklığına sahip 35 döngü kullanarak çalıştırın. Numuneleri, bir XTAE tamponu kullanarak santimetre başına 2 voltta% 10'lik bir aros jel üzerinde çözün. Ardından, delesyon olmayan ve delesyon bantlarının varlığı veya yokluğu için numuneleri inceleyin.

Delesyon ve delesyon olmayan PCR primer çiftlerini tek bir reaksiyonda çoğullamak için bir strateji düşünün. Alternatif olarak, silme ve silme olmayan PCR reaksiyonlarını ayrı ayrı çalıştırabilirsiniz. Süspansiyon hücreleri için, tüm klonları, kuyucuk başına 50 mikrolitre hücre kültürü ortamı içeren tek bir 96 oyuklu plakaya aktarın.

Daha sonra her oyuktan 50 mikrolitreyi 96 oyuklu bir PCR plakasına aktarın. Alternatif olarak, yapışma hücreleri için, tripsin, gözler, tek bir 96 oyuklu plakaya aktarılmadan önce klonlar. Daha sonra, her bir oyuktan 50 mikrolitreyi 96 oyuklu bir PCR plakasına aktarın, PCR plakasını beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin ve PCR plakasını bir lavabonun üzerine iterek süpernatanı çıkarın.

Şimdi, oyuk başına 50 mikrolitre DNA ekstraksiyon solüsyonu ekleyin ve genomik DNA ekstraksiyonundan sonra hücre peletlerini yeniden askıya alın, klonlardan delesyon olmayan ve delesyon bantlarını tespit etmek için PCR reaksiyonlarını çalıştırın. PCR ürünlerini santimetre başına 2 voltta% 10 aros jel üzerinde çözün. Bir XTAE arabelleği kullanarak.

İstenen silme ile klonları tanımlayın ve kültürleri daha büyük bir plaka veya şişede çoğaltın. Gösterilen örnekte, soldan sağa ebeveyn hücrelerini, üç delesyon olmayan klonu, üç mono alelik delesyon klonunu ve üç bi alelik delesyon klonunu gözlemleyin. Birden fazla örtüşmeyen SG r NNA çiftinin kullanılması, hedef dışı etkilerin kontrol edilmesine yardımcı olabilir.

Her çift, benzersiz bir silme işleminin üretilmesine yol açacaktır. Gene göre çeşitli konumlardaki SG çiftlerini hedefleyen kesme noktası, alellerden biri veya her ikisi silinmemiş olsa bile veya belirli bir izoformun bozulmasına izin vermek için çerçeve kayması indelleri oluşturmak için tüm gen gövdesini silmek için kullanılabilir. Bu deneyde.

Tüm genin silinmesi ile ilgili olarak, PIM bir iki SG RNA çifti, PX 3 3 0 ekspresyon vektörüne klonlanmış olarak tasarlandı ve elektroporasyon ile MEL hücrelerine verildi. GFP raportörü ile birlikte, GFP pozitif hücrelerin ilk %3'ü, delesyonun sınırlanmasında klonal olarak kaplandı ve bu PIM bir delesyon için delesyon olmayan mono alelik ve biyo alelik delesyon klonları için PCR ile tarandı. Biyo alelik delesyon klonları, genişleme için beş gün izin verildikten sonra daha fazla çoğalma için seçildi.

Her klon, BIC delesyonunu ve delesyonunu doğrulamak için genomik DNA'nın PCR'si ile yeniden test edildi. Amplikonlar, kesin silmeyi tanımlamak için Sanger dizilimine tabi tutuldu. RNA, BIC delesyon klonlarından izole edildi ve PIM bir ekspresyonunun kaybını doğrulamak için R-T-Q-P-C-R ile analiz edildi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, hayati delesyon klonlarını tanımlamak için birkaç hafta içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, CRISPR plazmitlerini inceleyerek, GFP parlak hücrelerini sıralayarak ve BioE delesyon klonları için geleneksel PCR ile bireysel klonları tarayarak genomik delesyonlar oluşturmak için CRISPR CAS dokuz nükleaz sisteminin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.