Su Kimya ve Deniz Mikrobiyoloji A Field Guide - Okyanusu'nda gaybı Oyuncular çözülüyor

Bu prosedürün genel amacı, temel biyokimyasal arka plan parametrelerini ve su ekosistemlerini değerlendirmek için uzak saha konumlarında çevresel numuneleri toplamak ve işlemektir. Bu, önce ilgili konumlardan yeterli miktarda tavizsiz numune alma suyu toplanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, ek işlem her zaman kontaminasyon potansiyeli ortaya çıkardığından, numune alma kabının ekstra taşıma adımlarından kaçınırken verimli bir iş akışına izin veren filtreleme veya konsantrasyon sistemleri kurmaktır.

Daha sonra, her numune hedeflenen parametrelere bağlı olarak filtrelenir veya konsantre edilir. Son adım, her bir numuneyi ilgili analitin gereksinimlerine göre işlemek veya sabitlemektir. Sonuç olarak, mikroskopi, viral ve mikrobiyal bolluğu ve mikrobiyal biyokütleyi doğrudan saymak ve viral ve mikrobiyal metagenomik örneklerin kalitesini doğrulamak için kullanılır.

Bu yöntem, viral ve mikrobiyal topluluk dinamiklerini karakterize etmek ve anlamak için gerekli minimum ve bilgileri elde etmek için gerekli temel parametreleri değerlendirmek için araçlar sağlar. Mevcut yöntemlere göre bu tekniğin temel avantajı, laboratuvar ortamından bağımsız, sahada test edilmiş kapsamlı bir iş akışı sağlamasıdır. Prosedürü gösteren, sıra laboratuvarında bir öğrenci olan Emma Church olacak.

Örneklerin toplanması bu videoda gösterilmemiştir, ancak beraberindeki protokol metni sürecinde açıklanmıştır. Kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için çözünmüş organik karbon veya DOC ile başlayarak, burada gösterilen sırayla numuneler, daha önce toplanan iki hatay akraba ünitesinden birini ve filtrasyon setinin ilgili yuvasını monte edin. İlgili filtre tutucusuna giden çıkış borusunu bağlayın.

Basınçlı hava tüpünü akraba ünitesine bağlayın. Tüm hatları 100 mililitre numune suyu ile yıkayın. Ardından, her bir filtre tutucusuna 25 milimetre önceden kesilmiş bir GFF filtresi yerleştirmek için asitle yıkanmış forseps kullanın.

Her DOC yüksek yoğunluklu polietilen şişeyi ve kapağını yaklaşık 20 mililitre filtrelenmiş örnekleme suyu ile üç kez durulayın. Her DOC şişesini yaklaşık 40 mililitre örnekleme suyu ile doldurun. Taşıma sırasında olası kontaminasyon veya kayıp durumunda yedeğini almak için DOC numunelerinin en az kopyalarını toplayın.

DOC numuneleri toplandıktan sonra analiz yapılana kadar numune alma şişelerini eksi 20 santigrat derecede dik durarak dondurun. Geçenler de dahil olmak üzere toplam 500 mililitre bir GFF filtresinden geçene kadar filtrelemeye devam edin. DOC örneklerini toplarken hat içi filtre tutucusunu sökün.

Partikül organik madde veya POM analizi için filtreyi çıkarmak için forseps kullanın ve filtreyi önceden kesilmiş bir alüminyum folyo karesinin içine yerleştirin. Kendi üzerine dönmüş üst tarafı katlayın ve sarın. Filtreleri, inorganik besinleri işlemek için elementel ve izotopik analize tabi tutulana kadar saklamak için eksi 20 santigrat derecede dondurun.

Her filtre tutucusuna 0,2 mikrometre raylı kazınmış bir filtre yerleştirin. Filtre kasetlerini tekrar takın, her 20 mililitrelik plastik sintilasyon şişesini örnekleme suyuyla üç kez yeniden takın. Her şişeyi omzunuza kadar doldurun.

Daha sonraya kadar eksi 20 santigrat derecede dondurun. Analiz. Mikroskopi için numune hazırlamak için filtre tutucuyu çıkarın ve iki mikro santrifüj tüpünün her birinde bir mililitre su toplayın. Daha sonra kullanılacak alikotlardan birine 66 mikrolitre% 32 paraldehit ekleyin.

Siber altın boyama için, daha sonra dappy boyama için diğer alikot'a 12 mikrolitre %25 glutaraldehit ekleyin. Yavaşça karıştırın ve numunelerin en az 15 dakika sabitlenmesine izin verin. Karanlıkta oda sıcaklığında, mikroskopi için numuneler bir saat içinde işlenmelidir.

Akış sitometrisi için numune hazırlamak için, kalıntıları ve büyük eary hücrelerini dışlamak için filtre tutucularından birine sekiz mikrometrelik bir polikarbonat filtre yerleştirin. Her numune alma alanı için iki kriyo şişesini doldurmak için numune alma suyunu geçirin. Bir mililitre numune ile, her kriyo şişesine beş mikrolitre %25 glutaraldehit ekleyin.

Karıştırmak için şişeleri ters çevirin ve numunelerin oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika sabitlenmesine izin verin. Daha sonra flaşlayın, numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve bir akış sitometresinde analiz edilene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Mikrobiyal metagenomik numuneleri hazırlama prosedürüne başlamak için, hat içi filtre tutucularını doğrudan çıkarın.

22 mikrometre silindirik bir nokta monte edin. İlgili satıra filtreleyin. Her bir bölgeden her iki şapka derisi ünitesinin kalan numune suyunu bir filtreden süzün.

Filtrasyondan sonra, hava ile doldurulmuş 10 mililitrelik temiz bir şırınga kullanarak kalan suyu her filtreden dışarı itin. Filtreyi orijinal ambalajına geri yerleştirin ve paketi laboratuvar bandı ile kapatın. Ayrı ayrı paketlenmiş filtreleri eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Ardından, viral metagenomik örnekleri hazırlayın. Hiçbir numunenin kaybolmamasını veya çevre tarafından kontamine olmamasını sağlamak için numuneleri hemen yıkanmış kovalara aktarın. Konsantrasyondan önce kalıntıları ve hücresel materyali çıkarmak için büyük gözenekli bir naylon ağ kullanarak ön filtreleyin.

Teğetsel akış filtrelerini veya TFF'yi bu şemada gösterildiği gibi ayarlayın. Bir numune kovasına bir teslimat hattı yerleştirin ve geri dönüş ve süzüntü hatlarını bir lavaboya bırakın. Peristaltik pompayı açın ve hatları bir ila iki litre numune suyu ile yıkayın.

Döngüyü tamamlamak için dönüş hattını numune kovasına yerleştirin ve deniz suyunu konsantre ederken 0,7 bar geri basınç ekleyin. Seviye düştükçe numune haznesini doldurun. Su seviyesi kovadaki hat girişinin altına düştüğünde, konsantreyi ağartıcıyla yıkanmış üçlü durulama gezisi zayıf behere aktarın ve konsantre etmeye devam edin.

Rezervuar boşsa, geri basıncı çıkarın, pompa hızını artırın ve tüm numuneyi hatlardan iterek tripo beherde geri kazanın. Herhangi bir viral soy ayrımı yapmadan çoğu bakteriyi uzaklaştırmak için konsantreyi nokta 45 mikrometre silindirik filtrelerden geçirin. Viral filtrelenmiş 45 mikrometre noktasını toplayın.

50 mililitrelik tüplerde konsantre olun. Noktayı 45 mikrometre silindirik filtreleri değiştirin. Filtrelenmiş viral konsantre toplandıktan sonra her 150 mililitreden sonra, artık bakterilerin karıştırılmasını önlemek için her 50 mililitrelik alikota 250 mikrolitre kloroform ekleyin.

Tüpleri sonraki işleme kadar dört santigrat derecede dik olarak saklayın. Son olarak, 0.45 mikrometre filtrelerini kurutun ve mikrobiyal metagenomik örnekler için gösterildiği gibi saklayın. Mikrobiyal ve viral örneklerden genomik DNA'nın ekstraksiyonu bu videoda gösterilmeyecektir, ancak prosedür ekteki protokolde bulunur.

Mikroskopi örneklerinin metin temsili analizi burada gösterilmektedir. Bakteri ve virüslerin bolluğunu ve boyut dağılımını ölçmek için benekli lekeli ve siber altın lekeli slaytlar incelenir. Toplanan numuneler, toplam bakteri hücrelerinin sayısını belirlemek için akış sitometrisi yoluyla ototrof te heterotrofik mikropların oranı için daha fazla değerlendirilir ve numuneler siberg yeşil olanla boyanır, Boyanmamış numunelerde ototrofların bolluğunu saymak için klorofil ve FICO eryn için bir kanal kullanılır.

ST olmayan leke kısmından ototrof sayıları daha sonra viral benzeri partiküllerin izolasyonu ve saflaştırılmasını takiben heterotrofik mikropların bolluğunu belirlemek için siber lekeli toplam sayımdan çıkarılır veya viral partiküllerin varlığını ve saflığını doğrulamak için vlp epi floresan mikroskobu kullanılır. Bu grafikler, temsili mikrobiyal metagenom verilerini göstermektedir. Göreceli senkronizasyon bolluğu.

Occus SPP, mercanın yüzde örtüsü ile pozitif korelasyon gösterir. Ella Backer, SPP'nin aksine, konjuge transfer için metabolik yollar nitrat konsantrasyonları ile pozitif korelasyon gösterdi. DNA onarımı için metabolik yol tüm Metagenomlar arasında tutarlı olsa da, bu tablo iki adadan üretilen iki viral genomun veri özelliklerini sunmaktadır.

Bu ikinci tablo, bir keşif gezisi sırasında çeşitli bölgelerden gelen su kimyası verilerini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, uzak tarla konumlarındaki organik ve inorganik besin mevcudiyetini ve viral ve mikrobiyal toplulukların bolluğunu ve yapısını kapsamlı bir şekilde nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.