Name: Bir Ex vivo Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Öğrenin, iki foton mikroskobu ile omurilik yaralanmalarında akson ve miyelin dinamiklerini gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, akson dejenerasyon mekanizmalarını canlı dokuda incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DPS, kısmen PVA Araştırma Vakfı'ndan sırasıyla #2665 ve #2934 hibelerinden geçmiş ve mevcut desteği kabul eder. PKS, Alberta Innovates - Sağlık Çözümleri Bilimcisidir, işletme fonları Calgary Üniversitesi Leblanc Omurilik Araştırmaları Kürsüsü tarafından sağlanmıştır.

NOT: Tüm hayvan prosedürleri Federal düzenlemelere bağlı kalarak, Louisville Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen kurallar çerçevesinde gerçekleştirildi. Düşük Ca 2+ ve 2 mM Ca 2 + Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (aCSF) 1. hazırlanması guruplarına <ol><li> Tablo 1&#39;de açıklandığı gibi 2x düşük Ca 2 + (0.1 mM) Stok C tampon, 2x, normal Ca 2 + (2 mM) Stok bir tampon ve 2x Stok B tampon hazırlayın. Bireysel stok solüsyonları iyon içeriği değiştirilmesine izin (örn, düşük ya da sıfır, Ca + 2) ve bir aya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Diseksiyon sırasında intrakardiyak perfüzyon için, 1x düşük Ca 2+ aCSF yapmak için plastik bir şişenin içine 2x düşük Ca 2 + Stok C 100 ml ve 2x Stok B 100 ml ekleyin. Mix ve 4 ° C&#39;de gece boyunca saklamak veya taze yapmak. </li><li> Imag sırasında ex vivo olarak omuriliğin perfüzyon içining 1x aCSF oluşturmak için bir 1 L&#39;lik bir cam şişe içine 2 x normal bir Ca + 2 Hazır A 500 ​​ml ve 2 x stok B 500 ilave edin. Karıştırınız ve oda sıcaklığında gece boyunca depolamak ya da taze olun. </li><li> 7.4 aCSF tampon pH ayarlayın. Oda sıcaklığında aCSF tutarken, buz üzerinde düşük Ca 2 + aCSF yerleştirin ve kabarcık karbojen gazı ile iki tampon (% 95 O2;% 5 CO2) 30 dakika önce, perfüzyon sırasında sürekli olarak kullanmak için. </li></ol> Ex Vivo Görüntüleme Odası 2. Hazırlık <ol><li> ACSF şişe etrafında bir ısıtma battaniye (hayır otomatik kapanır) sarın ve düşük / orta ayarda ısı ayarlayın. </li><li> Şekil 1A &#39;da gösterildiği gibi iki kutuplu bir sıcaklık kontrol ve geri besleme sıcaklık probu vasıtasıyla kontrol edilir ısıtıcı bir perfüzyon pompaya ve hat-içi bağlı şişe içine özel bir CSF perfüzyon hattı yerleştirin. </li><li> 2-foton uyarma / conf düz bir mikroskop sahne eki (152 x 102 mm) takınocal mikroskop sahne bir dökülme kabı ile donatılmış. </li><li> Büyük bir açık-banyo perfüzyon odasına yerleştirin (G x U x Y; 12 x 24 x 8 mm) dökülme kabına (uygun ex Şekil 1B görmek uyum ve ex vivo omurilik taze oksijenli aCSF sürekli akışını sağlamak için ) odası tasarımı görüntüleme vivo. </li><li> Uygun boru kullanılarak ex vivo görüntüleme odasının giriş-line ısıtıcının metal çıkış portuna bağlayın. Görüntüleme sırasında tampon / doku sıcaklığını korumaya yardımcı olmak için, ex vivo görüntüleme odasının altında ince bir emici pedi yerleştirin. </li><li> Çıkarılabilir yapışkan yapışma kullanarak dökülme konteyner / sahne ucun altına ex vivo görüntüleme odasına uyun. yapışkan tack malleability AMAÇ ışık yolu doku yüzeyine dik olduğundan emin olmak için gerektiği gibi odası ayarlanır sağlayacaktır. Gerekirse, bölme ayarlamak için bir daireye düzeyini kullanır. </li><li> Güvenli birbölmesi sıvı girişinin yakınına, ısıtıcısı geri besleme sıcaklık probu ve oda çıkışında bir elektrik hattına bağlı bir paslanmaz çelik emme tüpü. Manyetik bant ve uygun mikropipet sahipleri, bu bağlamda da faydalıdır. Vakum kaynağı açın. </li><li> Oksijenli aCSF ile görüntüleme odasını dolduran başlamak için perfüzyon pompası açın. Dakika başına 1.5-2 ml perfüzyon pompası ayarlayın. </li><li> Vakum hattı ayarlayarak görüntüleme odasında aCSF düzeyini kontrol eder. Bu omurilik kesimi kapsayacak ve su daldırma objektif ve doku yüzeyi arasında yeterli çalışma mesafesi sağlamak için görüntüleme odasının yeterli aCSF olması önemlidir. Doku segmenti tamamen için deneyci kaynaklı eserler önde gelen taze oksijenli aCSF altındayken değilse miyelin ve akson zararlı etkilenebilir. </li><li> Görüntüleme odasında o perfüzyon sıcaklığı oda sıcaklığına yakın yani in-line ısıtıcı sıcaklık kontrolörü ayarlayın. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Yetişkin Kemirgen Servikal Omurilik diseksiyonu <ol><li> Intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi sodyum pentobarbital (200 mg / kg) aşırı dozda enjekte edilerek bir yetişkin, 6-10 haftalık thy1 -YFP transjenik fare (Dorsal kök ganglion nöronlarının floresan protein ekspresyonu sahip kullanılması uygun suş) ile öldürülür. </li><li> Bir kez anestezi seviyesinin doğru (örneğin, ayak tutam ve göz kırpma refleksinin kaybı yok reaksiyon), dikkatle cerrahi makası ile omurilik ve beyin örten cilt tıraş altında. Betadin ve% 70 etanol yastıkları kullanarak cildi temizlemek. </li><li> % 70 etanol ile göğüs / karın alan Sprey, daha sonra soğutulmuş, karbojen-kabarmış düşük Ca kullanarak transkardiyal konuyu serpmek 2+ aCSF. (Bakınız Şekil 1C önerilen diseksiyonu tezgah üst kurmak). </li><li> Karaciğer sönük kalır gibi, küçük bir klip kullanarak kalbin içine perfüzyon iğne sabitleyin. Traş dorsal yüzü erişmek için konu üzerinde çevirinkonu ve% 70 etanol ile traş bölgeyi silin. </li><li> Beyin ve omur sütunu (Şekil 2A) maruz diseksiyon makas kullanarak kalça burun başlayarak orta hat boyunca dorsal cilt kesi yapmak. Burun ve kalça de işaretçilerine koyarak hazırlık sabitleyin. </li><li> Bu noktada bir diseksiyon mikroskop kullanarak, sıkıca koku ampuller düzeyinde kafatasının dorsal yüzeyi boyunca kesti. Kesi lateral kenarları içine makas ipuçlarından birini yerleştirin ve bilateral beyincik kadar takke kenarlarında kesilmiş. NOT: diseksiyon boyunca omurilikten örten doku kaldırmak için daha sonra gerekli gibi tamamen takke tüketim etmeyin (Şekil 2B bakınız). </li><li> Beyin maruz takke kaldırın. Yavaşça (beyincik bulunan) interparietal kemik sol ve sağ kenarları kesilmiş ve (beyin sapı / omurilik maruz kaudal geri Şekil 2C çekin </strong&gt;). </li><li> Masa yüzeyine 45 ° açıda ince uçlu makas kullanın ve posterior sinir köklerine ikili sadece alt vertebra kesti. NOT: Parlak beyaz dorsal sütunları ile temastan kaçının. Bu lifler (Şekil 2B) yansıması olacak ve kolayca zarar görebilir olanlardır. </li><li> Keser omuriliği ortaya çıkarmak için yapılır gibi yavaşça tek parça örten doku çekerek, ince uçlu forseps ile vertebral kolonun takke ve dorsal yüzeyini kaldırın. Sonraki görüntüleme (Şekil 2E) servikal kord 1-2 cm&#39;lik bölümünü izole etmek üst torakal düzeyde vertebra kesmeye devam. </li><li> Sütununun altında vertebral kolon ve net dokuya doku / kemik paralel kesmek için makas kullanın. Mümkün olduğunca aynı seviyede bu kesim yapmak. Kord görüntüleme için seviyede olacak şekilde doku bölmesi içinde olmasını sağlayacak çok önemlidir. </li><li> Geçmiş (beyin sapı transect için 11. neşter kullanıngracile fasikül liflerin) ve servikal spinal kord segmenti izole üst torakal düzeyde sonlandırma () Şekil 2F Bkz. Bu aynı iki noktada doku / kemik kesmek için makas kullanın. İzole doku kuyruk beyin sapı, servikal genişleme ve üst torakal spinal kord (Şekil 2G) kapsayan vertebral kolonun 2/3 içermelidir. </li><li> Karbojen-kabarmış, soğutulmuş düşük Ca bir petri 2+ aCSF içine izole omuriliğe yerleştirin. Gerekirse bu çanak düz yatıyor kadar, omurganın altında doku kırpın. </li><li> Ex vivo görüntüleme odasına izole belkemiğine aktarın ve 36 için 1 saat boyunca perfüzyon sıcaklık artışı - 37 ° C. Görüntüleme sırasında bu sıcaklığı korumak. </li></ol> Nil Kırmızı Görüntüleme Odası ve Miyelin Etiketleme içine Ex Vivo Omurilik 4. Yerleştirme <ol><li> Dikkatle i vertebra sütun güvenliğiniUygun bir montaj dilim ile maging odası aşağı ince lycra parçacığı oluşan dikey ızgara platformu ile modifiye tutun (Şekil 3A görmek omurilik için yer sağlamak için ızgara platformu orta Konuları kaldırmak). </li><li> (DMSO içinde 5 mM&#39;lik bir stok ve süzüldü 0.22 um, 4 ° C, ya da karanlıkta -20 ° C&#39;de 6 ay, 1 ay boyunca saklanabilir) Nil kırmızısı bir kısım çözülme. Sadece görüntüleme odasına Nil Kırmızı eklemeden önce, perfüzyon pompa akışını azaltmak ve odasında sıvı daima omuriliği kapsar emin olmak için vakum hattı ayarlayın. </li><li> Kord (Şekil 3B) kaudal ucuna yakın görüntüleme odasına 5-10 ul Nil Kırmızı stok solüsyonu ekleyin. Yavaşça oda boyunca, Nil Kırmızısı karıştırmak için 1 ml pipet kullanın. Nil Kırmızı, sonra 1-2 dakika odasında kalmak geri vakum hattı koyun ve sürekli omuriliği serpmek için min başına 1.5-2 ml perfüzyon pompası ayarlamak için izin ver. </li><li> Dikkatle mikroskop sahne yükseltmeksuya daldırma hedefi odasında aCSF yüzeyinden yaklaşık 10 mm kadar ve omurilik segmentinin merkezi ve medial dorsal sütunlar üzerinde hedefi hizalayın. Hafifçe aCSF yüzeyine temas edene kadar yavaşça aşağıya hedefi getirmek için mikroskop burun parçası odak tekerleğini kullanın. Görüş alanı (Şekil 3C) içine dorsal sütunları odaklanmak bir epifluorescent ışık kaynağı kullanın. </li></ol> TPLSM ve Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Fare Omurilik 5. Ex Vivo Görüntüleme (Lisci) Not: arka damar ince yapılı fasikül elyafları gibi doku merkezi için yararlı bir marker sağladığını (sırt kök ganglion hücre gövdesinden çıkan ve T6 arasından çıkmak ve aşağıdaki omurilik orta hat boyunca), bu kan damarı paralel uzanır. kalın YFP + servikal dorsal kök projeksiyonları da lifler yükselmek gibi yararlı bir işaretleyici sağlamak ve Y yanal inmekKüçük bir çapa sahip olan AP + ince yapılı fasikül lifleri. <ol><li> Spinal kord dokusu uygun hizalanmış sonra, lazer tarama moduna geçiş artan gracile fasikül miyelinli liflerin temel görüntüleme gerçekleştirmek için. Hem YFP ve Nil Kırmızı heyecanlandırmak için, floresan emisyon izole etmek 950 nm dalga boyunda (~ bir 25X, 1.1 NA amacı çıkışında ölçülen 17 mW) ve uygun dichroics (DM) ve bant geçiren filtreler için ayarlanmış bir iki-foton lazer kaynağı kullanın fluorophores (biz sarı-turuncu, kırmızı ve genişletilmiş kanalları, sırasıyla içine YFP ve Nil Kırmızı ayırmak için, 525/50 DM560, 600/60 DM640 ve 685/70 kullanın). <ol><li> Akson fazla% 3 temel görüntüleme (30-60 dakika) sırasında aksonal sferoidler gösteriyorsa nedeniyle deneyci kaynaklı eserler hazırlık atın. </li></ol></li><li> 30.3X görüş alanını büyüterek bir Lisci indükleyin (bir ~ 20 mikron çapında ablasyon oluşturmak için). Dinle 800 nm lazer ve en ~ 110 mW için lazer gücünü artırmakÖrnek. Lifler tamamen transeksiyon sağlamak için görünüm lazer taramaları 5 tam alanını izin verin. </li><li> (Numune, 2.08X de 950 nm, 17 mW) görüntüleme ayarlarına geri lazer ayarlarını değiştirerek Lisci onaylayın ve ablasyon görselleştirmek için doku tarayın. Ablasyon çapını doğrulayın ve birincil ablasyon aksonlar tamamen transeksiyon olduğunu (Şekil 3D bakınız). Yaralanma sonrası 8-10 + saat kadar yaralanma akson ve miyelin dinamik tepkisini kaydetmek için z yakalama ile birlikte mikroskop zaman atlamalı ayarlarını kullanın. NOT: ablasyon eksik ise (yani, liflerin eksik yaralanması), şaşırmış olacak birincil ve ikincil yaralanma mekanizmalarının belirlenmesi gibi, hazırlık atın. Buna ek olarak, izole spinal kord segmentleri Lisci bağımsız doku hasarı orta sadece hafif 24 saat sonrası Lisci kadar görüntülü olabilir. </li></ol>

<ol><li>Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+long-distance+axon+regeneration+in+the+injured+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS.</a> Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).</li>
<li>Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+mechanisms+regulating+axon+regeneration%3A+an+integrin+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective.</a> Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).</li>
<li>McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+in+combinatorial+approaches+for+spinal+cord+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration.</a> Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).</li>
<li>Pernet, V., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Nogo-A+in+axonal+plasticity%2C+regrowth+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair.</a> Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).</li>
<li>Bradbury, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitinase+ABC+promotes+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury.</a> Nature. 416, 636-640 (2002).</li>
<li>Cregg, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+beyond+the+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration beyond the glial scar.</a> Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).</li>
<li>Park, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+axon+regeneration+in+the+adult+CNS+by+modulation+of+the+PTEN%2FmTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway.</a> Science. 322, 963-966 (2008).</li>
<li>Coleman, M. P., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian+degeneration%2C+wld%28s%29%2C+and+nmnat%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).</li>
<li>Sulaiman, W., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+peripheral+nerve+injury%2C+regeneration%2C+and+functional+recovery%3A+from+bench+top+research+to+bedside+application%5BTitle%5D)+AND+%22Ochsner+J%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application.</a> Ochsner J. 13, 100-108 (2013).</li>
<li>Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+a+new+growth+cone+after+axotomy%3A+the+precursor+to+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).</li>
<li>Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorganized+microtubules+underlie+the+formation+of+retraction+bulbs+and+the+failure+of+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration.</a> J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).</li>
<li>Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+axonal+degeneration+%27dieback%27+in+the+corticospinal+tract+after+transection+injury+of+the+rat+spinal+cord%3A+a+confocal+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study.</a> J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).</li>
<li>Fishman, P. S., Mattu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+severed+cortical+projection+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Fate of severed cortical projection axons.</a> J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).</li>
<li>McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+activated+phagocytes+and+myelin+degeneration+to+axonal+retraction%2Fdieback+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury.</a> Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).</li>
<li>Stirling, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+treatment+reduces+delayed+oligodendrocyte+death%2C+attenuates+axonal+dieback%2C+and+improves+functional+outcome+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerschensteiner%2C+M+%22Nat+Med%22">Nat Med</a>. 11, 572-577 (2005).</li>
<li>Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+laser-scanning+microscopy+of+Ca2%2B+dynamics+in+visual+motion-sensitive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons.</a> Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).</li>
<li>Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+of+cortical+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo.</a> PLoS Biol. 2, 96(2004).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-+and+short-term+intravital+imaging+reveals+differential+spatiotemporal+recruitment+and+function+of+myelomonocytic+cells+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury.</a> J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).</li>
<li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+single+neuron+axotomy+triggers+axon+regeneration+to+restore+synaptic+density+in+specific+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits.</a> Nat Commun. 4, 2038(2013).</li>
<li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58, 1133-1144 (2010).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia%2C+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li>
<li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+microglia+in+the+mouse+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen-induced+perivascular+microglial+clustering+is+required+for+the+development+of+axonal+damage+in+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation.</a> Nat Commun. 3, 1227(2012).</li>
<li>Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+maintenance+of+molecular+domains+in+myelinated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons.</a> J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).</li>
<li>Stirling, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2-mediated+alternative+activation+of+microglia+is+protective+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury.</a> Brain. 137, 707-723 (2014).</li>
<li>Greenspan, P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrofluorometric+studies+of+the+lipid+probe%2C+nile+red%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red.</a> J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).</li>
<li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+red%3A+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).</li>
<li>Tajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+hemodynamic+response+to+acute+hyperoxia+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice.</a> Brain Res. 1557, 155-163 (2014).</li>
<li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80, 900-913 (2013).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+behavior+activates+Bergmann+glial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motor behavior activates Bergmann glial networks.</a> Neuron. 62, 400-412 (2009).</li>
<li>Tsutsui, S., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+injury+to+axons+and+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Metabolic injury to axons and myelin.</a> Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).</li>
<li>Matute, C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+white+matter+in+central+nervous+system+pathophysiologies%5BTitle%5D)+AND+%22ASN+Neuro%22%5BJournal%5D)">Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies.</a> ASN Neuro. 4, (2012).</li>
<li>Matute, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dyshomeostasis+in+white+matter+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium dyshomeostasis in white matter pathology.</a> Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).</li>
<li>Stys, P. K., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+matter+NMDA+receptors%3A+an+unexpected+new+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target.</a> Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).</li>
<li>Baltan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+anoxia%3A+a+tale+of+two+white+matter+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts.</a> Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).</li>
<li>Stirling, D. P., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axonal+injury%3A+internodal+nanocomplexes+and+calcium+deregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation.</a> Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).</li>
<li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys J. 89, 581-591 (2005).</li>
<li>Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axonal+spheroid+formation+in+central+nervous+system+Wallerian+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).</li>
<li>Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+membrane+sealing+in+injured+mammalian+spinal+cord+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons.</a> J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).</li>
<li>Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen,, R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+reticulum+Ca%282%2B%29+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu yüzey görüntüleme ex vivo olarak omurilik miyelinli aksonlar (yani, ince yapılı fasikül) zaman içinde hem birincil hem de ikincil miyelinli aksonal dejenerasyon dinamik ilerlemesini incelemek için bir lazer kaynaklı, omurilik yaralanması ile birleştirildi. Ex vivo görüntüleme için bir yöntem tarif Omurilik gibi hareket eserler ve uzun süreli görüntüleme oturumları sırasında deneyci kaynaklı hipoksi potansiyeli olarak in vivo görüntüleme ile ilişkili komplikasyonların çoğu üstesinde...

Akson Dejenerasyon nörotravma, inme, otoimmün ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere birçok nörolojik koşulları kapsayan morbidite önemli bir nedenidir. Periferik sinir sistemi (PNS), santral sinir sistemi aksine (MSS) aksonlar kez nedeniyle iç ve dış engelleri (yani, miyelin dejenerasyonu sırasında skar oluşumu sırasında üretilen ve serbest aksonal büyüme inhibitör molekülleri) 1 hem yaralı yenilemek için sınırlı bir kapasiteye sahip -7. Bu engellerin çeşitli yaygın araştırdı olmasına rağmen, tedavi amaçlı müdahaleler, MSS akson dejenerasyonu önlemek sağlam aksonal rejenerasyonu teşvik ve fonksiyonel connectively geri, sınırlı kalmaktadır. Bir kez soma ayrılmış aksonlar akson şişlik, sfero oluşumu ve (8 gözden) nihai parçalanma ile karakterizedir Wallerian dejenerasyon olarak bilinen dejenerasyonun bir basmakalıp sürecine tabi. Içindekontrast, nakledilen periferik akson soma ile süreklilik kalır proksimal güdük, sonraki aksonal rejenerasyon için hayati bir ön koşul gerekli, bir ucunda şişlik oluşturan geri Ranvier yakın düğüme ölür, ve sonra büyüme konisinin oluşumunu başlatabilir 9-11. Buna karşılık, birçok aksonlarda proksimal akson uçlarının, karakteristik &quot;endbulbs&quot; veya retraksiyon ampuller oluşturan büyüme konileri oluşturur, ve bunun yerine uzak onlar yaralanma 12-15 sonraki ay kalır yaralanma sitesinden geri çekmek için başarısız. Primer aksonal hasara ek olarak, ek akson hasarı / kaybı da büyük ölçüde ilk yaralanma bağışladı akson oluşabilir. Başlangıçta bağışladı akson Bu gecikmiş akson kaybı gibi ikincil aksonal dejenerasyon denir. Yaralanma MSS akson Bu doğal tepki fonksiyonel aksonal rejenerasyon beyin ve omurilikte ulaşmak için daha da zor hale golü. Ha ne kadaraksonal yaralanma (örneğin, sfero oluşumu, retraksiyon ampuller) ve llmarks iyi ölüm sonrası doku ve aksonal dejenerasyon deneysel modellerden karakterize edilmiştir, bu dinamik süreçleri altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması sınırlı olmuştur. Bu çalışmaların çoğu doğal zamanla bireysel akson yanıtları yakalamak için başarısız statik uç nokta gözlemlere dayanıyordu. Gerçi dışsal olarak aksonal izleyiciler statik bölümlerden ve canlı görüntüleme sırasında aksonal yanıtları aydınlatmak için yararlı olmuştur uygulanan genetik olarak kodlanmış aksonal belirteçlerin kullanılabilirliği floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak aksonlar görselleştirmek için yeteneğimizi oldukça geliştirdi. Nitekim, Kerschensteiner ve meslektaşları bir seminal rapor ilk spinal dorsal sütunları kendi projeksiyonlarını göndermek nöronların alt kümelerinin yeşil floresan proteinini kodlayan Thy1 GFP-S fareleri kullanarak in vivo aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon doğrudan kanıt sağladıkord 16. Canlı görüntüleme iki foton lazer tarama mikroskobu (TPLSM) kullanarak yaklaşımları ve ilgi hücrelerin genetik floresan protein etiketleme gibi aksonal dejenerasyon, Ca 2 + sinyalizasyon, aksonal rejenerasyon, astrosit fizyolojisi gibi birçok farklı dinamik süreçlere doğrudan kanıt ve mekanik anlayış vermeye devam mikrogliyal fizyolojisi ve yaralanma 17-25 yanıt. Akson aksine, çok az gerçek zamanlı olarak yaralanma miyelin tepkilerinin bilinmektedir. Miyelin PNS CNS ve Schwann hücrelerinde oligodendrositler tarafından üretilen ve tutulan beyaz cevherin önemli bir bileşenidir. Miyelin akson yüzeyinin% 99 yalıtım ve böyle yaparak son zamanlarda Buttermore ark. 26 tarafından gözden hızlı ve verimli saltatory darbe yayılımını destekleyen bir yüksek direnç, düşük-kapasite koruyucu kaplama sağlar. Biz solvatokromik, lipofilik kullanmak yaralanma miyelin dinamik tepkisini yakalamak içinFloresan boya Nil kırmızısı 27. Bu hayati leke solvatokromik özellikleri fiziko-kimyasal ortamına 28,29 bağlıdır emisyon spektrumunun spektral vardiya izin verir. Bu özellikler axomyelinic yaralanma mekanizmaları anlamak için yararlıdır ve uygun seçilmiş dichroics ve emisyon filtreleri kullanılarak görüntülendi veya spektral mikroskopi kullanılarak 27 çözülebilir. Örneğin, Nil Kırmızısı emisyon spektrumu mavi-kaydırılmış örneğin adipositler ve normal bir merkezi sinir sistemi miyelin (tepe emisyon ~ 580-590 nm) 27 bulunan bu gibi daha az polar lipid bakımından zengin ortamda bulunmaktadır. Buna karşılık, ~ 625 nm akson olarak oluşturulmuş endbulbs içinde bu hayati boyanın emisyon spektrumu zirveleri aksonal tepe kurumalarına 27 uğrarlar. Normal miyelin karşı endbulbs içinde özellikle bu spektral vardiya altında yatan kesin mekanizmalar belirsiz kalmasına rağmen, bu tür spektral değişiklikler, protein birikimi veya dağınıklığı yol altında yatan değişiklikler gösterebilirhidrofobik bağlama bölgelerinin 27 maruz kalma. In vivo görüntüleme kendi doğal ortamında omurilik aksonal yaralanma dinamiklerini gözlemlemek için nihai metrik iken, bu teknik açıdan zor ve önemli bir cerrahi uzmanlık gerektirir, ve sık sık (örneğin, inflamasyon ve yara deneysel eserler tanıtmak olabilir dorsal sütun açığa ameliyatları tekrar formasyonu). Buna ek olarak, pahalı ekipman genellikle mikroskop objektif mercek altında sağlam bir hayvanın süspansiyon ve konumlandırma izin vermek için gereklidir. hayvanlar dikkatle sıvılar doldurulan sağlamak için, nedeniyle uzamış anestezi görüntüleme oturumlara hipoksi hiçbir işaret olmadığından emin olmak için, sıcak kalmasını sağlamak için de izlenmesi gerekir. akson ve miyelin kesinlikle canlı kalması için sürekli perfüzyon ve yeterli oksijen seviyelerini gerektiren ikinci derece önemlidir. Ancak, bu genellikle bildirilen veya in vivo çalışmalar çoğu izlenmeztarihi. Buna ek olarak, kalp hızı ve solunum için hareket eserler (izofluran yetişkin fare anestezi: ~ dakika başına 300-450 atım (BPM)% 97-98 oksijen doygunluğunu (Normal oranı ~ 632 BPM) ve korumak için en uygunudur ~ 55-65 nefes dakika başına kaçınılmaz bu hareketin tabidir sırasıyla)) 30 bile hızlı lazer taramaları zorlu yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak birincil ve ikincil aksonal yaralanma yanıtları ayırt in vivo omurilik görüntüleme make sırasında karşılaşılan (Normal oranı ~ 163 dk başına nefes olduğunu) eserler. Uyanık hayvanlarda kemirgen omurilik görüntüleme izin verebilir bir implante sert vertebra çerçeveli pencere ile kombine ultra hızlı rezonans tarayıcıları gelişmeler, ancak daha hızlı tarama kez kaçınılmaz gürültü oranı aşağılayıcı görüntü kalitesi sinyali azaltır. Şu anda beyin görüntüleme için kullanılan spinal kord görüntüleme tekniklerindeki gelişmeler daha fazla bu engellerin birçoğu üstesinden gelmek ve ina tarafından tanıtıldı potansiyel boşa sınırlayabilirdequate doku perfüzyon, örneğin, 31-33. Beyaz cevher fizyolojisi ve beyaz cevher hasarı mekanizmaları hakkında bildiklerimizin çoğu vitro veya optik sinir, periferik sinir ve omurilik beyaz madde 34-41 şeritler beyaz madde ex vivo hazırlıklarında kullanılarak tespit edilmiştir. Çevresel faktörler değişiklikleri, canlı doku uyuşturucu ve reaktiflerin kontrollü uygulama, elektrofizyoloji kullanarak fonksiyonel değerlendirmeler ve akson doğrudan floresan mikroskop gözlemleri ve miyelin kontrollü izin gibi bu hazırlıklar beyaz cevher hasarı mekanizmaları bilgimizi ilerletmek için devam ediyor. Ancak, daha önceki bazı yaklaşımlar kaçınılmaz yakından karşı akson yanıtı etkileyebilir çıkarma aşamasında yüzey aksonları zarar omurilik dorsal kolon şerit veya ventral beyaz cevher şeritler aksonlar gözlemlemek için. Yukarıdaki deneysel manipülasyonlar yararlanmak ve A.Ş. zarar görmemesi içinomuriliğin dorsal doğrudan temasını engeller soruşturması kapsamında ry lifler, biz bir ex vivo servikal spinal kord modeli kullanın. Böylece, pia mater ve komşu yüzeysel dorsal kolon akson mimarisi izolasyonu sırasında canlı ve soğukkanlı kalır. Yaralanma sonrası 10+ saat - İşte onlar dinamik 8 gerçek zamanlı bir odak yaralanma cevap olarak, merkezi miyelinli akson doğrudan görselleştirme sağlar nispeten basit bir yaklaşım açıklar. Lazer kaynaklı omurilik yaralanması (Lisci) modeli mekansal zamanla kısıtlı kalır primer lezyon (ablasyon sitesi) gibi birincil ve ikincil aksonal yaralanma mekanizmaları arasındaki farklılaşmayı izin verir. açık banyo görüntüleme odası terapötik müdahale, reaktif teslimat ve çevre manipülasyonlara erişilebilir. Putatif axomyelinic koruyucu maddeler hızla doku sürecini kapsayan uzun ve masraflı deneyler karşı doğrudan gözlemlerle gerçek zamanlı olarak değerlendirilebiliring, bu nedenle, immün, görüntü yakalama ve analiz kesit ve canlı hayvanlarda deneysel maddeleri test etmeden önce akut yanıtları ve koruyucu manipülasyonlar değerlendirmek için yararlı bir vekil model sunar.

<table><tbody><tr><td>Dilim destekli büyük banyo odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td>Ex vivo görüntüleme odası için</td></tr><tr><td>Standart Dilim Destekleri</td><td>Warner Instruments</td><td>SS-3</td><td>Exvivo görüntüleme odası için</td></tr><tr><td>RC-27L ve RC-29 odaları için plastik dilim tutma</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-27LP/10</td><td>Ex vivo görüntüleme odası için</td></tr><tr><td>Emme Tüpü, Seri 20 Klasik Tasarım, solak</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-1L</td><td>Ex vivo görüntüleme odası için</td></tr><tr><td>Çözüm Hat içi ısıtıcı/soğutucu</td><td>Warner Instruments</td><td>SC-20</td><td>Görüntüleme sırasında perfüzat sıcaklığını düzenlemek için</td></tr><tr><td>Bipolar sıcaklık kontrolörü</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td>Görüntüleme sırasında perfüzat sıcaklığını düzenlemek için</td></tr><tr><td>Sıvı Soğutma Sistemi</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td>Perfüzatı düzenlemek için görüntüleme sırasındaki sıcaklık</td></tr><tr><td>Isıtıcı kontrolörleri için kablo montajı</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td>Görüntüleme sırasında perfüzat sıcaklığını düzenlemek için</td></tr><tr><td>CC-28 kablosu için yedek boncuk termisitörü</td><td>Warner Instruments</td><td>TS-70B</td><td>Görüntüleme sırasında perfüzat sıcaklığını düzenlemek için</td></tr><tr><td>Emme borulu manyetik tutucu</td><td>Bioscience</td><td>Tools MTH-S</td><td>Paslanmaz çelik vakum emişini tutmak için Boru&nbsp;</td></tr><tr><td>Ayarlanabilir tutucu Biyobilim</td><td>Araçları</td><td>MTH</td><td>Sıcaklık probunu tutmak için</td></tr><tr><td>şeffaf silikon dolgu macunu</td><td></td><td></td><td>Ex vivo görüntüleme odası</td></tr><tr><td>süper yapıştırıcı</td><td></td><td></td><td>için Ex vivo görüntüleme odası için</td></tr><tr><td>ince pleksiglas şeritler</td><td></td><td></td><td>Ex vivo görüntüleme odası için</td></tr><tr><td>nil kırmızısı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>N-1142</td><td>Miyelin etiketlemek için</td></tr></tbody></table>

bir ex vivo lazer kaynaklı omurilik felçlileri modeli gerçek zamanlı aksonal dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Yaralı MSS aksonlar rejenere ve genellikle uzak yaralanma sitesinden geri çekmek için başarısız. İlk yaralanma kurtulmuş aksonlar sonra ikincil aksonal dejenerasyonu uğrayabilir. Spinal kord içindeki büyüme konisinin oluşumu, rejenerasyon ve ek miyelinli akson projeksiyonlar kaybı olmaması büyük ölçüde yaralanma sonrası nörolojik iyileşme sınırlar. Omuriliğin miyelinli aksonları yaralanma nasıl tepki merkezi değerlendirmek için, biz kaderi belgelemek için sarı floresan akson protein ve fokal ve yüksek tekrarlanabilir lazer kaynaklı omurilik yaralanması ifade transgenik fareler kullanan omurilik modeli yaşayan bir ex vivo geliştirdi İki foton uyarma time-lapse mikroskopi kullanılarak akson ve zamanla miyelin (lipofilik floresan boya Nil Kırmızı). Akut aksonal yaralanma, akson retraksiyon ve miyelin dejenerasyonu gibi dinamik süreçler en iyi gerçek zamanlı olarak incelenmiştir. Ancak, çürük temelli yaralanmalar ve hareket eserler olmayan odak doğa karşılaştıyüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak zorlu birincil ve ikincil aksonal yaralanma yanıtları ayırt in vivo omurilik görüntüleme make sırasında. Burada anlatılan ex vivo omurilik modeli aksonal şişme, sfero oluşumu, akson Transeksiyon, ve gerçek-zamanlı olarak bu dinamik süreçleri incelemek için yararlı bir model sağlayan şişme peri-akson olmak üzere klinik olarak anlamlı kontuzyon / sıkıştırma kaynaklı aksonal patolojilerin çeşitli yönlerini taklit eder. Bu modelin önemli avantajları doğrudan akson ve ikincil yaralanma mekanizmaları yaralandı birincil hakaret arasındaki farklılaşmayı sayesinde mükemmel bir uzaysal çözünürlüğü vardır; doğrudan Perfüzat banyo kablosunu reaktif kontrollü infüzyon; Çevre ortamın kesin değişiklikler (örneğin kalsiyum, sodyum iyonları, aksonal yaralanma, ama imkansız yakın bilinen katkıda in vivo işlemek için); onlar görselleştirmek için bir fırsat olarak ve kemirgen modeller de bir avantaj sunuyoruz vegenetik belirlenen hücre popülasyonları ve hücre içi yapıları manipüle. Burada, biz izole etmek ve görüntü farelerin yaşayan omurilik akut aksonal yaralanma dinamiklerini yakalamak için nasıl açıklar.

Uygun bir canlılığı, izole korumak için gerekli kurmak laboratuar ve görüntünün Detayları ex vivo omurilik Şekil 1'de gösterilmiştir. Mikroskop ayarlanabilir darbeli femtosaniye lazer, uygun dicroics ve emisyon filtreleri ve bir su- ile donatılması gerekmektedir yüksek sayısal diyafram objektif lens daldırma (≥1.0). Diseksiyon sırasında omurilik canlılığını sağlamak için, prosedür izole akson membranlar 42 mühür için 2+ yeterli Ca veriyor soğutulmuş oksijenli düşük Ca <sup...

Akson ve miyelin yaralanmalarının dinamiklerini gerçek zamanlı olarak aynı anda görselleştirmek için iki foton uyarımlı hızlandırılmış mikroskopi kullanan bir protokol sunuyoruz. Önerilen bu protokol, yaralanma sonrası merkezi miyelinli akson kaderini etkileyebilecek ve kalıcı klinik sakatlığa katkıda bulunabilecek hem içsel hem de dışsal faktörlerin çalışmasına izin vermektedir.

Bir Ex vivo Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, akut aksonal dejenerasyon mekanizmalarını gerçek zamanlı olarak değerlendirmektir. Bu, uylukta bir YFP pozitif nöro ve omurilik dokusunun izole edilmesiyle, dokuyu oksijenli düşük kalsiyum, yapay beyin omurilik sıvısı ile sürekli olarak perfüze ederek elde edilir. Daha sonra omurilik dokusu, fizyolojik koşullar korunurken iki foton mikroskobu objektifi altında hizalanır ve miyelin, lipofilik floresan boya Nil kırmızısı ile boyanır.Daha sonra, kolonlar içindeki miyelinli aksonları kesmek için lazer gücü ayarlanarak bir dorsal kolonun dorsal yüzeyinde mikro boyutta bir lezyon oluşturulur. Sonuçlar, görüntülerin kantitatif ölçümlerine dayalı olarak hasarlı aksonların, peri aksonal, miyelin şişmesinin ve diğer hücresel yanıtların geri çekildiğini göstermektedir. Dolayısıyla bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tüm servikal omuriliği kullanmamız ve bu nedenle sırt kolon liflerinin sağlam kalmasıdır.Dolayısıyla bu, genellikle beyaz madde şeridinin hazırlanması sırasında meydana gelen altta yatan merkezi miyelinli liflere zarar gelmesini önler. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımda bu tekniği gerçekten savunan doktora sonrası bir araştırmacı olan Dr.Starlin Ada olacak İntrakardiyak perfüzyona hazırlanmak için. Ex vivo omuriliğin bolluğu için düşük kalsiyum, yapay beyin omurilik sıvısı veya iki kez konsantre stok BNC solüsyonları içeren bir BOS yapın.Görüntüleme sırasında, bir cam şişede iki kez stok çözeltileri A ve B ile normal A CSF'yi hazırlayın. Bu çözeltileri pH 7.4'e kadar sunun. Düşük kalsiyumlu A BOS'u diseksiyon alanının yakınında soğuk tutun ve normal A BOS'u mikroskobun yakınında oda sıcaklığında tutun.Her iki çözeltiyi de kullanmadan önce yarım saat boyunca araba ve benzinle köpürtün ve kullanımdayken sürekli olarak köpürtün. Ardından, görüntüleme için açık banyo perfüzyon odasını hazırlayın. İlk olarak, hat içi ısıtıcıların metal çıkışını hazneye bağlayın.Ardından, görüntüleme odasının konumunu hafifçe ayarlama potansiyeli olması için görüntüleme odasını iyi miktarda yapışkan malzeme ile dökülme odasına yapıştırın. Hat içi ısıtıcı geri besleme sıcaklık probunu sıvı girişinin yakınına sabitleyin ve paslanmaz çelik emme borusunu hazne çıkışındaki vakum hattına sabitleyin. Şimdi vakum pompasını ve perfüzyon pompasını açın.Hazne A BOS ile dolduğunda, pompayı dakikada 1,5 ila iki mililitreye kadar çevirin. Ardından, vakum hattının konumu ile haznedeki A CF hacmini kontrol edin. Altı ila 10 haftalık TH'yi bir YFP transgenik fareye ötenazi yapmak için.İlk olarak, refleksif ayak parmağı sıkıştırma tepkisi olmadığını onaylayın. Daha sonra omurilik ve beyni kaplayan bölgeyi tıraş edin. Tıraştan sonra, açıkta kalan cildi Betadine ve% 70 etanol ile silin.Şimdi göğüs ve karın bölgesine% 70 etanol püskürtün ve hayvan trans Cardi'yi karbojen kabarcıklı düşük kalsiyum A BOS ile perfüze edin. Karaciğer solmaya başladığında, perfüzyon iğnesini bir klipsle kalbe takın. Daha sonra hayvanı ters çevirin ve sırt derisi tarafını %70 etanol ile silin.Kafatası kapağını ve omurların üzerindeki dokuyu ortaya çıkarmak için burundan kalçaya kadar orta hat boyunca bir kesi yapın. Cildi kenara çekmek için pimler kullanın ve hayvanı burnundan ve kalçasından sabitleyin. Şimdi preparayı, koku soğanları seviyesinde kafatasının dorsal yüzeyi boyunca sıkıca kesilmiş bir makasla bir diseksiyon mikroskobuna taşıyın.Makas ucunu yeni yapılan kesiğe sokun ve beyinciği ortaya çıkarmak için kafatası kapağının her iki kenarını da kesin. Kafatası kapağını tamamen kesmeyin. Beyni açığa çıkaran kafatası kapağını kaldırın ve inter parietal kemiğin sol ve sağ kenarlarını beyincik üzerinde dikkatlice kesin.Şimdi, kafatası kapağını ve dorsal vertebral kolon yüzeyini nazikçe çekerken, omuriliği daha fazla ortaya çıkarmak için arka sinir köklerinin hemen altında kesikler yapın. Daha sonra ince uçlu makas kullanarak omurları iki taraflı olarak dikkatlice kesin. 45 derecelik bir açıyla, sırt kolonlarına zarar vermekten kaçınmak hayati önem taşır.Bu parlak beyaz lifler dikkatli olmadan kolayca zarar görür, omurları keserken eksize edilen kemik ve kası nazikçe geri çekmeye devam eder. Görüntülemeye uygun bir servikal omurilik dokusu segmentini izole etmek için bir ila iki santimetre kesin. Daha sonra dokuyu ve kemiği omur kolonuna paralel olarak kesmek için makas kullanın.Ayrıca kolonun altındaki dokuyu da temizleyin. Bu kesileri mümkün olduğunca düz yapın çünkü görüntüleme için dokunun oda seviyesinde düz durması çok önemlidir. Son olarak, beyin sapını çim ulu liflerinin sonlandırılmasından ve üst torasik seviyeden geçirmek için 11 numaralı neşteri kullanın.Daha sonra bu iki noktadan doku ve kemiği kesmek için makas kullanın. İzole edilen doku, kordal beyin sapını, servikal genişlemeyi ve üst torasik omuriliği kapsayan vertebral kolonun üçte ikisini içermelidir. İzole edilmiş omurgayı ex vivo görüntüleme odasına aktarın ve perfüz sekiz sıcaklığını bir sonraki saat içinde kademeli olarak 36 ila 37 santigrat dereceye yükseltin.Görüntüleme sırasında bu sıcaklığı koruyun. Bu protokolün kritik bir yönü, sırt kolon liflerine zarar vermeden omuriliği izole ettiğinizden emin olmaktır. Bu protokolün ikinci en kritik yönü, omuriliğin sürekli olarak oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı ile perfüze edilmesini sağlamaktır.Modifiye edilmiş bir doku sürgü tutucusu kullanarak, omur kolonu hazneye dikkatlice sabitleyin. Açıkta kalan omuriliğe, sırt kolonlarına dokunmaktan veya beğeni iplikleri iplikleriyle üzerlerine baskı uygulamaktan kaçınmak önemlidir. Şimdi miyelini lekelemek için, çözelti akışını kısaca durdurun ve vakum hattını çıkarın.Omuriliğin kordal ucuna yakın beş ila 10 mikrolitre beş milimolar Nil kırmızı boyası ekleyin. Daha sonra çözeltiyi görüntüleme odası boyunca nazikçe karıştırın ve dokunun bir veya iki dakika inkübe etmesine izin verin. Lekelendikten sonra, oksijenli A BOS akışını dakikada 1,5 ila iki mililitre arasına geri getirin ve iki foto mikroskop kullanarak vakum hattını değiştirin.Suya daldırma objektifi kullanarak omuriliği görüntüleyin. Objektifi yavaşça A BOS yüzeyine indirin ve ardından AF floresan ışığı altında omuriliği netleyin. Şimdi yükselen çimlerin temel görüntülemesi için tarama moduna geçin.Oculus miyelinli lifler. YFP ve Nil kırmızısını uyarmak için, uyarımı 950 nanometreye ayarlayın ve floresan emisyonlarını DI kronik ve büküm geçiren filtrelerle izole edin. Görüntülemeden sonraki bir saat içinde aksonların% 3'ünden fazlasının steroid içerdiğini fark ederseniz, bu, omuriliğin izolasyon sırasında hasar gördüğü anlamına gelir.Şimdi preparasyonu atmak en iyisidir Lazerle dokuyu yaralamak için. İlk olarak, dokunun düz görünen bir alanını bulun. Ardından görüntüleme alanı büyütmesini 30,3 x'e yükseltin.Lazeri 800 nanometreye ayarlayın ve gücünü yaklaşık 110 miliwatt'a yükseltin. Şimdi beş görüş alanı lazer taraması gerçekleştirin. Sonuçlar 20 mikron çapında tam bir ablasyon olmalıdır.Lazerle 17 miliwatt ve 20.08 x büyütme ile standart görüntüleme ayarları altında yaralanmayı kontrol edin. Ablasyondaki aksonal lifler tamamen kesilmezse, preparatı atın. Şimdi, dinamik yaralanma müdahale kayıtları yapmak için Z yakalamalı hızlandırılmış ayarları kullanın.Hazırlık 24 saate kadar görüntülenebilir. Bir omurilik segmenti izole edildi ve başlangıçta T-P-L-S-M'de tarif edildiği gibi konumlandırıldı. Kayıtlar, miyelinli çim eklem saksonlarını, birkaç aksonal steroid veya aksonal dejenerasyonun diğer morfolojik belirtileri ile kılıf dinar kırmızı lekeli miyelin içinde paralel hizalanmış YFP pozitif aksonlar olarak gösterir.Ok uçlarıyla vurgulanan ROM VA'nın burnu gibi ince detaylar görülebilir. Lazerin neden olduğu omurilik yaralanmasından 40 dakika sonra. Kesilen aksonların çoğu karakteristik aksonal uç ampuller oluşturur ve yaralanma bölgesinden geri çekilir, yaralanma bölgesine komşu aksonlar sekonder dejenerasyona uğrar ve aksonal şişlik daha belirgin hale gelir.Üç ayda bir geri çekilen liflerin aksine, lezyondan ve steroidlerden distal olarak bulunan geri çekilen aksonal uç ampullerin çoğu, akson içinde çevresel bir değişiklik olduğunu düşündüren Nil Kırmızısı ile güçlü bir şekilde etiketlendi. Yedi saatte, aksonlar lezyon bölgesinden geri çekilmeye devam etti. Bununla birlikte, bu lezyondan distal veya rostral yerleşimli uç ampullerde, lezyonun proksimal veya kordalinde bulunan uç ampullere göre daha belirgindir.Sonuçta, başlangıçta korunan aksonlar yavaş yavaş gecikmiş sekonder dejenerasyona uğradı. Bu videoyu izledikten sonra, nöro ve omuriliği nasıl izole edeceğinizi ve lazerle indüklenmiş omurilik yaralanmasını nasıl gerçekleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu nedenle, hem birincil hem de ikincil aksonal dejenerasyonun dinamik yönlerini gerçek zamanlı olarak inceleyebileceksiniz.Bu model sistemin kullanılmasından elde edilen bilgiler, yaralanma sonrası hem akson hem de miyelin hasarının önemli mekanik anlayışına yol açabilir.

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Fare spinal kolon stabilize ve tekrarlayan gerçekleştirmek için minimal invaziv bir...

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

Lazer nanodissection bağlanmış iki foton görüntüleme, hücre içi çözünürlük ile merkezi sinir sisteminin dejeneratif ve rejeneratif işlemlerini incelemek için yararlı araçlardır. Bu protokol, etiket görüntü ve in vivo serebellar korteks bir tırmanma lifleri incelemek için gösterilmiştir.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Bu videoda, bir canlı fare dorsal spinal kord üzerinde kronik optik görüntüleme odasını yerleştirmeye yönelik bir prosedür açıklanmaktadır. odası, cerrahi işlem ve kronik görüntüleme gözden ve gösterilmiştir.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü İn Vivo Fare Omurilik Görüntüleme

İki fotonlu intravital görüntüleme, dorsal kolon travmatik omurilik ezilme yaralanması olan kemik iliği kimerik bir hayvanda omurilikteki farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Fare omuriliği görüntülenmesi için yeni bir ex vivo hazırlık. Bu protokol, omurilik boyunca canlı hücresel etkileşimlerin iki foton görüntüleme için izin verir.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Biz dinamik spinal vasküler değişiklikler yetişkin Sprague-Dawley Sıçanlarda contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip izlemek için iki farklı floresan boyalar kullanarak yöntemi Imaging bir vivo tanıtmak.

İçinde bir Vivo Vasküler Dynamics Contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip görüntüleme için duo-renk yöntemi

Burada, duyusal nöron - vivo içinde birleştirir dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli, canlı görüntüleme Drosophila , İki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ve güçlü sinek genetik araç, olarak bir iletişim kuralı'nı mevcut olası rehberleri ve neuroregeneration inhibitörleri süzmek için bir platform.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

Elektroporasyon genler çıkarlarının hücrelere teslim etmek için etkili bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım içinde vivo yetişkin fare dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar üzerinde uygulayarak, biz axon yenilenme içinde vivoçalışmaya bir modeli açıklar.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Bu protokol, larva elleçlemesi için otomatik bir mikroakışkan platform ile birleştirilmiş bir lazer lezyon sistemi kullanarak zebra balığı larvalarında dokuya özgü ve yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanmaları indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır.

Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar

Öğrenin, iki foton mikroskobu ile omurilik yaralanmalarında akson ve miyelin dinamiklerini gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, akson dejenerasyon mekanizmalarını canlı dokuda incelemeyi sağlar.

Bir Ex vivo Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Daha fazla video keşfet