Kültür ve Co-Kültür Mouse Yumurtalıklar ve Yumurtalık Foliküller

Bu prosedürün genel amacı, yenidoğan yumurtalıklarını ve/veya tek tek yumurtalık foliküllerini in vitro olarak büyütmektir. Bu, ilk önce uygun yaştaki soğuk dişilerden yumurtalıkların diseksiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, akupunktur iğneleri ile tek tek yumurtalık foliküllerinin ince diseksiyonu da dahil olmak üzere dokuyu hazırlamaktır.

Daha sonra yenidoğan yumurtalıkları veya bireysel pre antral foliküller düzenli besleme ile kültürlenir ve son adım, histolojik veya moleküler analiz için dokuyu sabitlemek veya dondurmaktır. Sonuç olarak, kültür sistemi gelişimi oldukça fizyolojik bir şekilde destekler ve yumurtalık folikülü gelişiminin düzenlenmesini incelemek ve ilkel ve büyüyen yumurtalık folikülleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sağlam yumurtalık foliküllerinin folikül gelişimi yoluyla desteklenmesi ve destekleyici matrislere ihtiyaç duymadan üç boyutlu yapılarını korumasıdır.

Bu yöntem, yumurtalık biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve ayrıca kemoterapi, ilaçlar ve dolayısıyla kadın doğurganlığı gibi toksik bileşiklerin etkilerini araştırmaya yardımcı olabilir. İlk olarak, büyüyen foliküllerin dinlenme halindeki ilkel folikül havuzu üzerindeki etkilerinin nasıl araştırılacağını tartışırken, yumurtalık foliküllerinin farklı yaşlarını ve dolayısıyla aşamalarını birlikte kültürleme fikrimiz vardı, Steph Morgan ve Lisa Campbell ile birlikte tekniği gösteren, laboratuvardan bir teknisyen olan Vivian Allison ve uzun yıllar laboratuvarda doktora sonrası bilim adamı olan Allison Murray olacak. Her ikisi de tekniğin temel yönlerinin geliştirilmesine yardımcı oldu: Bu protokol için pipetleri çekmek.

Cam pipetleri bir alev üzerinde ısıtın ve bükün ve bir cam kesici kullanarak temiz bir kesim yapın. Daha sonra kavisli camı 160 santigrat derecede yaklaşık 45 dakika sterilize edin. Tekniğiniz için pipette doğru eğriyi elde etmek pratik gerektirir.

Pipeti her zaman bir cam kesici ile kesin, böylece pürüzlü cam kalmaz. Ayrıca, dokunuz için doğru çapa sahip olduğunuzdan emin olmak istersiniz Lebowitz L 15 besiyerinden yapılmış diseksiyon ortamını BSA ile 0,2 mikronluk bir filtreden sterilize etmek için üretilmiştir. Bu, yenidoğan yumurtalık kültürünü sterilize etmek için inşa edilmiş 25 milimetre çapındadır.

Sadece 25 milimetre çapında başka bir 0,2 mikron filtreden geçirin ve steril bir tüpte toplayın. Daha sonra, 24'ün her bir oyuğuna bir mililitre yenidoğan ortamı ekleyin. Kuyucuk plakası ve her bir oyukta ortamın yüzeyine bir zar aktarın.

Folikül kültürü ortamı da yumurtalık kültürü ortamı gibi filtreyle sterilize edilir. Daha sonra silikon yağı da filtre ile sterilize edilmelidir. Daha sonra, üst sıra boyunca 30 mikrolitrelik folikül ortamı damlası ile 96 kuyu kültür plakasını onarın.

Bu kuyucukları 70 mikrolitre silikon yağı ile dikkatlice kaplayın. Alternatif olarak, folikül folikül ko-kültürü, 100 mikrolitre silikon yağı kaplaması ile 100 mikrolitre ortam gerektirir. Daha sonra, oyuk başına bir mililitre ortam ve çok dikkatli bir şekilde yerleştirilmiş UV ile sterilize edilmiş nükleer po membranı ile folikül yumurtalık ko-kültür plakaları hazırlayın.

Her steril cam embriyo kabına bir mililitre diseksiyon ortamı aktararak başlayın. Doğum sonrası sıfır ila beş günlük yavruları boyadıktan sonra, karın duvarını kaplayan cildi ince forseps ile kavrayın ve cilt ve vücut duvarını içine alın. Karnı açığa çıkaran bu büyük kesiği çekerek açın.

Mesane genellikle bu aşamada tıkanır ve diseksiyonu kolaylaştırmak için delinebilir. Saatçi forsepslerini kullanarak bağırsakları bir kenara çekin. Sonra her iki tarafta da mesaneden böbreğe kadar rahim boynuzlarını takip edin.

Yumurtalık, rahmin üst kısmında böbreğin hemen altında bulunan bulut benzeri bir yapıdır. Yumurtalığı nazikçe ve makas kullanarak kavrayın. Rahimden serbest bırakın.

Her iki yumurtalığı da inceledikten sonra, ılık diseksiyonla doldurulmuş bulaşıklara aktarın. Orta. İnsülin iğneleri kullanarak yumurtalıkları incelemek için 37 santigrat derecede ısıtılmış bir aşamaya sahip bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Bazal torbayı ve fallop tüpü de dahil olmak üzere fazla materyali sadece yumurtalık kalana kadar kesin.

Daha sonra her bir yumurtalığı kavisli bir pipet kullanarak hazırlanmış bir plakanın kuyucuğuna aktarın. Her zar kültürüne bir yumurtalık yerleştirin, doku ortamı değiştirirken altı güne kadar her gün ortamın yarısını değiştirirken, zarı rahatsız etmemek için pipet ucunu ortamın kuyusunun kenarına yerleştirin. Kültürlemeden sonra, yumurtalıklar donmuş veya sabit veya histoloji veya immünokimya olarak saklanabilir.

Yumurtalıkları yaşlı farelerden ılık diseksiyon ortamından bir tabakta topladıktan sonra, yumurtalık Basa'yı çıkarın. Bazal torbayı ve fallop tüpü de dahil olmak üzere fazla materyali sadece yumurtalık kalana kadar kesmek için insülin iğneleri kullanın. Daha sonra iğneleri kullanarak yumurtalıkları ikiye bölün ve her bir yarıyı dikkatlice bir mililitre diseksiyon ortamı içeren ayrı bir saat camına aktarın.

Saat camlarını bir cam sürgü ile örtün ve mümkün olan en kısa sürede bir saate kadar fırında saklayın. Lamina akış başlığında ısıtılmış bir aşamaya sahip bir mikroskop altında çalışarak, geç pre antal folikülleri tanımlamak için insülin iğneleri kullanarak yumurtalıkları büyük parçalara ayırın. Pre antal foliküller iki ila üç tabaka granüloz hücresi içerir ve yaklaşık 180 ila 200 mikrometre çapa sahiptir.

Bunlardan herhangi birini bir satır içi iğne ve bir iğne tutucu ile sabitlenmiş bir akupunktur iğnesi kullanarak inceleyin, bazal laminaya zarar vermekten kaçının, ancak çevredeki S stroma'yı çıkardığınızdan emin olun. Bu pratik gerektirir. Folikülün bir miktar dışkı dokusuna ihtiyacı vardır, ancak çok fazla değil.

Ayrıca, diseksiyon işlemi çok kaba olursa, folikül hasar görür ve yırtılır veya ölür. Kültür sırasında, Kullanıcı, folikülleri dikkatlice yeni bir orta dolu saat camına aktarmak için perpe hazırladı. Folikülleri, diseksiyon mikroskobuna takılan kalibre edilmiş bir mercek kullanarak perpetin ince kalibreli bölümünde tutun.

Folikülleri ölçün. 190 mikrometre çapının 10 mikrometre yakınındalarsa. Kültür için kullanılabilirler, seçilen foliküllerden diğer folikülleri atarlar.

Kültür için sadece en sağlıklı olanı seçin. Daha koyu retik alanlar olmadan yarı saydam olmalılar, sağlam bir bazal laminer ve bazı bağlı tekal dokuya sahip olmalıdırlar. İyi bir verim yumurtalık başına 10 ila 15 foliküldür.

Şimdi hazırlanmış kavisli bir perpe kullanarak, bu folikülleri hazırlanan 96 kuyulu kültür plakasına aktarın. Yağ tabakasının ve kültürün altındaki her kuyucuğa bir folikül yerleştirin. Foliküller her gün altı güne kadardır.

Medya ile yeni bir satır hazırlayın. Bir saat veya daha uzun bir süre sonra, folikülleri bir sonraki taze dengelenmiş ortam sırasına aktarın veya folikül folikül kokültür kültürleri iki folikülü yan yana bir arada kültürleyin. Transferler yerine, ortamın yarısını her gün değiştirmek için ince bir jel uç kullanın.

Folikül yumurtalığı için, kokültürler bir folikülü bir kültür plakasındaki bir zar üzerine yerleştirilmiş bir yenidoğan yumurtalığına aktarır, folikülü yenidoğan yumurtalığının bir kutbunun yanına dikkatlice yerleştirin, böylece daha sonra birbirleriyle temas ettirilebilirler. Bu kültürü beş güne kadar sürdürün. Her gün 500 mikrolitre ortamın değiştirilmesi.

Pre antal foliküller sıklıkla yenidoğan yumurtalıkları tarafından kapsüllenir. Bu kültür sırasında, yenidoğandan alınan yenidoğan yumurtalıkları altı gün boyunca kültürlendi ve üreme toksik maddelerine maruz bırakıldı. Kültürün ikinci gününde, foliküllerin farklı aşamalarının sayısını ve sağlığını belirlemek için dokular işlendi.

Araştırılan bir toksik madde sisplatindi. İncelenen diğer toksik madde doksorubisin idi. Farklı bir deney, gonadotropin folikül uyarıcı hormon ve luteinize edici hormonun bireysel foliküllerin büyümesi üzerindeki etkisini araştırdı.

Ancak bu analiz folikül boyutu, büyümelerini haritalamak için periyodik olarak ölçüldü. Folikül folikül ko-kültürü, folikülü eksprese eden bir GFP kullanılarak araştırıldı ve vahşi tip folikül süreçleri birinden diğerine uzandı. Bu ko-kültürün immünohistokimyasal olarak işlenmesi, GFP süreçlerinin vahşi türler içinde yattığını ortaya çıkardı.

Tekal tabaka, vahşi tip neonatal overler de GFP eksprese eden folikül ile ko-kültürdü. Bu senaryoda, GFP süreçleri yumurtalık interstisyumundan geçti. Yenidoğan yumurtalık kültürü oldukça basit bir yöntemdir, ancak hasar görmemiş sağlam pre antral folikülleri diseksiyon tekniğinde ustalaşmak için biraz zaman harcamayı bekleyin.

Bu, onların doğru gelişimi için çok önemlidir. Folikül kültürünü takiben yumurtalar tüp bebek tedavisi ile döllenebilir, daha sonra embriyolar yalancı gebe kadınlara transfer edilebilir ve canlı yavrular elde edilebilir.