Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

Burada, kalp ve kas progenitör hücrelerinin ve mikro çevrelerinin biyolojisini incelemek için faringeal kemerleri kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Bu prosedürün genel amacı, faringeal mezodermdeki kalp ve kas progenitörlerinin bakımını, göçünü ve kaderini incelemektir. Bu, önce taze hasat edilmiş bir fare embriyosundan faringeal kemerlerin diseksiyonu ile gerçekleştirilir. Daha sonra, kemerler, bağlanmalarını kolaylaştırmak için bir medya filmine yerleştirilir.

Faringeal ekplan içindeki veya buradan göç eden hücreler daha sonra günlük olarak izlenir. Sonuç olarak, Cree tabanlı floresan soy izleme, faringeal arklar içindeki kalp ve kas progenitörlerinin göç farklılaşmasını ve yenilenmesini izlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kardiyak veya kas progenitörlerinin yenilenen bir popülasyonunu ve bunların mikro çevresini in vitro olarak incelemek için tek ex vivo sistem olmasıdır.

Bu yöntemin gösterilmesi kritiktir, çünkü 9.5 günlük fare embriyolarındaki ebeveyn kemerleri sadece iki ila 300 mikrometre boyutundadır, bu da önceden görselleştirme olmadan tanımlanmasını ve incelenmesini çok zorlaştırır. Prosedüre başlamadan önce. Coda 12, %10 FBS ile desteklenmiş PBS'li kuyu plakası.

Bir saat sonra, kaplama çözeltisini oyuk başına 200 mikrolitre serumsuz ortam ile değiştirin. Bir ortam filminin kuyu diplerinin tüm yüzeyini kapladığından emin olmak için plakayı döndürün. Daha sonra, ötenazi uygulanmış bir hamile farenin karnını% 70 etanol ile püskürtün ve temizleyin.

Daha sonra steril aletler kullanarak deniz bölgesinde 0,5 santimetrelik bir kesi yapın. Kesiğin üstündeki ve altındaki cildi tutun ve yavaşça zıt yönlerde çekin. Daha sonra rahmi ortaya çıkarmak için göbek deliğinden karnın her iki yanındaki yumurtalıklara kadar zarda V şeklinde bir kesi yapın.

Rahmi yumurtalığa bağlayan yumurta kanalını forseps ile ve yumurtalık tarafındaki yumurta kanalını makasla sıkıştırarak rahmi yumurtalıktan kurtarın. Uterusu uct tarafından yavaşça yukarı çekerek. Rahmi mesane bölgesinden serbest bırakın.

Daha sonra uterusu uct tarafından daha da yukarı çekin ve uterusu karın boşluğundan serbest bırakarak diğer taraftaki UCT'yi kesin. Uterusu, kalsiyum ve magnezyum içeren 20 mililitre soğuk, steril PBS içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Kanı yıkamak için tüpü 10 saniye boyunca hafifçe sallayın.

Daha sonra uterusu 10 mililitrelik bir tabağa aktarmak için forseps kullanın ve dokuya beş mililitre soğuk PBS ekleyin. Daha sonra, bir stereo mikroskop altında, uterusu nazikçe açmak için iki çift forseps kullanın ve embriyoları içeren amniyotik torbaları birer birer inceleyin. Daha sonra sırayla her embriyo için, amniyotik kesesi bir çift forseps ile sıkıştırın ve nazikçe çıkarın, diğer çifti kullanarak torbayı embriyodan kesmek ve serbest bırakmak için.

Embriyoyu yan yatırın ve birinci ve ikinci kemeri, kemer ile faringeal kese arasında kalbe arkaya doğru kesmek için forseps kullanın. Embriyoyu çevirdikten ve diğer taraftaki kemeri kestikten sonra sadece gösterilmiştir. Kemerleri embriyoya bağlayan kardiyak çıkış yolunu kesin ve çıkarın.

İki faringeal kemerin her birini kalan kardiyak çıkış yolundan ve dört bağırsak endoderminden sıkıştırın ve serbest bırakın. Sırasıyla, daha sonra dokuları, kemerlerin ortamla örtülmemesine dikkat ederek, kaplanmış 12 oyuklu plakanın ayrı ayrı oyuklarının merkezine aktarın. Bağlanmayı kolaylaştırmak için, kemerleri hücre kültürü koşulları altında inkübe edin.

İki saat sonra, kuyucukların kenarlarına 200 mikrolitre 37 santigrat derece, serum içermeyen ortam ekleyin, kemerlerin bağlı kalmasına dikkat edin ve dokuları gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kemerlerin hala bağlı olduğunu görsel olarak doğruladı. Daha sonra kuyucuklara yavaşça 200 mikrolitre daha 37 santigrat derece serum içermeyen ortam ekleyin.

Dokular çözülür ve yüzmeye başlarsa, sadece bir ortam filmi kalana kadar kemerleri çıkarmadan ortamı bir pipetle nazikçe çıkarın. Ardından, kemerleri kuyunun ortasına geri taşımak için pipet ucunu kullanın ve dokuları tekrar inkübe edin. Her iki günde bir, geliştirme sırasında buharlaşmış herhangi bir ortamı 100 ila 200 mikrolitre taze, orta ile değiştirin.

Yüz kası ve kalp progenitörleri, birinci ve ikinci faringeal arktan sırasıyla baş ve kalp kas sistemi haline gelmek üzere çoğalırken ve göç ederken izlenebilir. Faringeal kemerlerin kültürlenmesi, kalp ve kas gelişimini ex vivo olarak ayrıntılı olarak incelemek için benzersiz bir yol sunar. CRE kilit sistemi kullanılarak, fare mezoderm dölleri, 36 ila 72 saatte ex vivo kültürden sonraki 24 ila 48 saat içinde Cree ekspresyonu üzerine floresan raportörler tarafından izlenebilir.

Kardiyomiyosit oluşumu, ikinci kemer içinde kendiliğinden kasılan göç eden hücre kümelerinin yanı sıra spesifik kardiyomiyosit belirteçlerinin analizi ile görsel olarak doğrulanabilir. Üç ila yedi günlük kültürden sonra, miyotüp ve yüz kası oluşumu, ilk ark içinde uzamış ve kendiliğinden kasılan hücreler olarak ve gelişiminden sonra spesifik kas belirteçlerinin analizi ile görselleştirilebilir. Bu teknik, kalp ve kas kök hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, genişleyen progenitörleri ve nişlerini in vitro olarak doğrudan izlemelerinin ve incelemelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, gelişmekte olan fare embriyolarından foral kemerlerin nasıl diseksiyon edileceğini ve in vitro olarak nasıl kültüre alınacağını iyi anlamış olmalısınız, bu da kalp ve kas pro generatif gelişiminin ex vivo olarak incelenmesine olanak tanır.