Sırt kök ganglion Modeli: Kanserli Sinir Invasion Vitro Modelleme

Bu video makale, pankreatik duktal adenokarsinomda dorsal kök gangliyonları (DRG)/kanser hücresi modelinin kullanımını göstermektedir.

Bu modelin genel amacı, kanserli nöral mikroçevreyi özetlemektir. Bu, kanser hücresi nöron etkileşimlerinin araştırılmasını sağlar. Bu yöntem, tümör hücresi ve nöronlar arasındaki etkileşim ve her bir setin karşılıklı etkisi gibi tümör mikroçevre alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, nöral nişteki hem hücresel hem de serebral faktörleri ele alması, gerçekleştirmesi ve güvenilir olmasıdır. Bu tekniğin etkileri, kanser gelişimi boyunca nöral yeniden şekillenme ve invazyon sürecindeki anahtar faktörlerin terapötik gelişimine ve farmakolojik hedeflemesine kadar uzanır. Hayvanı bir CO2 odasında ötenazi yaptıktan sonra, kürkü% 70 etanol ile ıslatın ve kurumasını bekleyin.

Fareyi yüzüstü pozisyonda sabitleyin ve ardından arka boyundan kereste omurgasına kadar kraniyokaudal olarak uzanan bir orta hat kesisi yapın. Daha sonra, dermal flepleri bilateral olarak kaldırmak ve deri altı dokusunu ortaya çıkarmak için forseps kullanın. Kraniyoservikal bağlantı tanımlanana kadar fare kafatasını palpe edin.

Kraniyoservikal kavşakta servikal kasları ve omurgayı kesmek için hayvana dik açılı makas kullanın. Ardından, omurgayı kaudal olarak inceleyin ve beşinci bel omurunda tam bir kaudal transeksiyon yapmak için makas kullanın. Daha sonra, fareyi sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve orta hat boyunca boyundan karın bölgesine kadar bir kesi yaptıktan sonra, cildi yanal olarak geri çekin ve ardından peritonu kesin.

Kraniyel olarak, göğüs duvarını makasla açın. Peritoneal ve retroperitoneal organları çıkardıktan sonra, kaburgaları kesmek için forseps ve cerrahi bir bıçak kullanın ve vertebral kolondan çıkıntı yapan yaklaşık beş milimetre kaburga bırakın. Vertebra kolonu vücudun geri kalanından çıkarın.

ve soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Omurgayı, 4X büyütme ile donatılmış bir stereo mikroskop altında yapışık olmayan bir emici platform üzerinde aynı kranyokaudal oryantasyonda yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Bu stereo mikroskoptan bakarken, tüm omurga kaslarını ve bağ dokusunu çıkarın.

Kaburgaları, omurgayı terk ederken sinirler için yer işareti olarak kullanın. DRG servikal, torasik ve lomber vertebralarda bulunur. Omur gövdesini orta hatta kesmek için makas kullanın, omuriliğe bir pencere oluşturun ve ardından omuriliği ve DRG köklerini ortaya çıkarmak için omur gövdesini nazikçe geri çekin.

Ardından, yaylı makas kullanarak DRG'yi ortaya çıkarmak için üst kaburgayı çıkarın. Periferik siniri, DRG'nin lateral kaburgası boyunca medial olarak takip edin. Sinirin üzerinde yatan kızarmış bir yumurtanın sarısı gibi görünen DRG'yi tanımlayın.

DRG'nin distalindeki interkostal siniri kesin ve retraksiyon için kullanılacak gangliyonların distalinde iki ila üç milimetre sinir bırakın. DRG'yi sıkıştırmadan veya zarar vermeden forseps kullanarak efferent siniri dikkatlice kavrayın. Şimdi siniri yanal olarak çekerek DRG'ye nazikçe geri çekin.

Daha sonra ön ve arka kökleri DRG'ye yakın kesin. İzole edilmiş DRG'yi buz gibi soğuk takviyeli DMEM ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir petri kabına aktarın. Laminer akış başlığında çalışarak, buz üzerindeki bir kağıt ızgaraya 35 milimetrelik bir cam tabanlı petri kabı yerleştirin.

Önceden soğutulmuş bir pipet ucu kullanarak, ızgaranın ortasına yaklaşık 10 mikrolitre büyüme faktörü tükenmiş ECM dağıtın. Çanağa 2 ila 4X büyütme altında stereo mikroskopla bakarken, DRG'yi ECM'nin ortasına, tabağın dibine yakın bir yere yerleştirin. Birleşen kültürlerden 40.000 kanser hücresi toplandıktan ve yıkandıktan sonra, pelet ve 40 mikrolitre ECM'yi buz üzerinde yeniden süspanse edin.

Bir kez daha, ızgarayı stereo mikroskopla görüntüleyin, DRG'den 500 mikron ölçün ve bu noktada 10 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın. DRG'den tüm yönlerde tekrarlayın. Çanağı katılaşması için laminer akış başlığında 10 ila 15 dakika bırakın, ancak kurumasını bekleyin.

ECM katılaştıktan sonra, plakanın yan duvarına pipetleyerek yavaşça takviye edilmiş DMEM ekleyin. ECM'yi kaplayacak kadar yaklaşık iki mililitre ortam ekleyin. DMEM ilavesi, DRG'nin plaka tabanından ayrılmasını önlemek için plakanın yan duvarına pipetlenerek çok yavaş yapılmalıdır.

Plakayı doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve kültürü korumak için protokolün yazılı kısmındaki talimatları izleyin. Bu mikrograf, tohumlamadan sonraki sıfırıncı günde görüş alanının üst kısmında DRG'yi ve görüş alanının altında kanser hücrelerini gösterir. Burada, aynı kültür tohumlamadan yedi gün sonra gösterilir.

Oklarla gösterildiği gibi, kanser hücreleri DRG nöronu boyunca göç eder. Bu histogram, farklı kanser hücrelerinin DRG sinir istila indeksini gösterir. Kpc 989 ve MiaPaCa hücrelerinin QLL2 veya NIH3T3 hücrelerine göre daha yüksek sinir invazyon indeksine sahip olduğu görülebilir.

Bu koordinat grafiği, kırmızı ile gösterilen sinir ile temas halinde olan bir Kpc kanser hücresinin ve mor ile gösterilen bir QLL2 hücresinin göç yolunu göstermektedir. X ve Y koordinatları gösterilir. Bu şekil, aksonal temas ile göç eden QLL2 kanser hücreleri için menşe mesafesinden bir analizi göstermektedir.

Burada Kpc kanser hücreleri için orijin mesafesi gösterilmiştir. Her durumda, göç yönü sinir ganglionuna doğruydu. Bu prosedürü denerken, kontrol oranı %100 olmadığı için gerekenden daha fazla gangliyon hazırlamayı unutmamak önemlidir.Geliştirildikten sonra, DRG güdüsü, kanser araştırmaları alanındaki araştırmacıların tümör mikroçevresi içindeki nöral nişi keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, faredeki DRG gibi anatomik yer işaretlerini nasıl tanıyacağınızı, DRG'yi nasıl çıkaracağınızı ve son olarak DCM'de nasıl kültürleneceğini iyi anlamış olmalısınız. DRG'nin kanser hücreleri ile birlikte kültürlenmesi de sunulmaktadır.