Farelerde Omurilik Yaralanma Modeli Olarak Odak iskemisi Fototromboz kaynaklı
16 Temmuz 2015
Fototromboz, omurilikte fokal iskemiyi indüklemek için minimal invaziv ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir prosedürdür ve farelerde omurilik yaralanması modeli olarak hizmet eder.
Bu prosedürün genel amacı, farelerde kolay ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir omurilik iskemisi modeli geliştirmektir. Bu, önce T dokuz ila T 12 omurlarını ortaya çıkarmak için farenin sırt yüzeyinin cerrahi olarak diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, arka omurilik damarlarını açığa çıkaran T 10 veya T 11 omurlarının sırt yüzeyini inceltmek için yüksek hızlı bir matkap kullanılır.
Daha sonra kan damarlarını etiketlemek için retroorbital kök yoluyla bir foto aktif boya uygulanır. Son adımda, omuriliğin dorsal yüzeyindeki arka omurilik damarları, açıkta kalan kan damarında foto trombozu indüklemek için ışınlanır. Sonuç olarak, omurilik yaralanmasının sonucu nissle, boyama ve immünohistokimya ile değerlendirilir.
Bu tekniğin etkileri, omurilik yaralanmasından sonra hücre sağkalımını ve iyileşmesini iyileştirmeyi amaçlayan çeşitli nöroprotektif ilaçların etkinliğini test etmek için kullanılabileceğinden, omurilik iskemisi tedavisine kadar uzanır. Prosedürü göstermek, hem Dr. Hem de laboratuvarından bir araştırma görevlisi olan Nana olacak.
Ameliyata başlamadan önce, lamba gücünü stabilize etmek için metal müttefik lambayı 30 dakika önceden ısıtın. Daha sonra 10 x objektif ve teorik kullanarak, aydınlatılan bölgenin boyutunu 0,75 milimetre çapa ayarlamak için alan diyaframını dik bir FN bir epi floresan mikroskobunda ayarlayın. Daha sonra, anestezi uygulanmış bir farenin her iki gözüne de suni gözyaşı merhemi sürün ve hayvanı önceden ısıtılmış bir ısıtma yastığına yerleştirin.
Ayak parmağınızın sıkışmasına yanıt vermeyerek uygun anestezi durumunu onaylayın. Ardından, orta hattın etrafındaki hayvanın sırt yüzeyindeki tüyleri kırpmak için elektrikli bir saç düzeltici kullanın. Cerrahi bölgeyi% 70 etanol ile ovalayın, ardından üç kez Betadine çözeltisi uygulayın ve ardından hayvanı örtün.
Şimdi, hayvanı sabitlemek ve uzun bir boyun bölgesini korumak için bir burun kelepçesi kullanarak cerrahi bir platform üzerindeki homeo temalı bir ısıtma yastığı üzerine yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Daha sonra T dokuzdan T 12 torasik omurlara kadar dorsal orta hat boyunca bir kesi yaparak ameliyata başlayın. Bir neşter kullanarak cerrahi alanı ortaya çıkarmak için cildi bir kenara iterek, T dokuz ila T 12 omurlarının sırt dikenlerini ortaya çıkarmak için kası dikkatlice temizleyin ve steril bir pamuklu çubuğun nazikçe uygulanmasıyla kanamayı gerektiği gibi durdurun.
Daha sonra, T 10 ila T 12 omurlarını çevredeki kastan ayırın ve hayvanı stabilize etmek ve kemik parlatma matkap ucu ile donatılmış yüksek hızlı bir matkap kullanarak herhangi bir hareketi önlemek için bir vertebral kelepçe ile sabitleyin. Şimdi, arka omurilik venini ve omuriliğin dorsal yüzeyindeki diğer küçük damarları görselleştirmek için T 10 veya T 11 omurun sırt yüzeyini dikkatlice ve nazikçe inceltin. Bu adım sırasında dikkatli olun, çünkü aşırı basınç, matkabın omurilik boşluğuna girmesine ve omuriliğe zarar vermesine neden olabilirken, kemiğin eşit olmayan şekilde incelmesi, düzensiz infarkın yanlış eliminasyonuna ve üretilmesine neden olabilir.
İnceltme prosedürü sırasında termal hasarı önlemek için, kalıntıları gidermek için sürekli emme ile birlikte yumuşak ve sabit bir normal tuzlu su akışı uygulayın. Daha sonra bir neşter kullanarak, ana damar açıkça görünene kadar kemik yüzeyini dikkatlice düzeltin. Omuriliğe zarar vermemeye özen göstermek.
Kan damarı göründüğünde, foto aktif boyayı retroorbital sinüs yoluyla uygulamak için bir insülin şırıngası kullanın. Enjeksiyondan üç dakika sonra, fototrombozu indüklemek için kan akışını bir lazer doppler akış ölçer ile ölçün. Hayvanı, omuriliğin açıkta kalan bölgesi doğrudan mikroskobun 10 x objektifinin altına gelene kadar fareyi hareket ettiren, yüksekliği ayarlanabilir bir laboratuvar jakı üzerinde ayarlanabilir bir XY pozisyonuna, ayarlanabilir bir sahneye yerleştirin.
Işık kaynağının gücünü %12'ye ayarlayın ve incelmiş omuriliğin ortasındaki açıkta kalan bölgeyi 10 x objektif boyunca iki dakika boyunca ışınlayın. Işınlamanın başında ve sonunda, her görüntü yakalama zamanını kaydederek görüntüler elde edin. Kanama gözlenmezse, omuriliğin her iki yanındaki kaslarla birlikte yüzeysel fasyayı kapatmak için emilebilir dört oh büyüklüğünde bir sütür kullanın, ardından cildi aynı şekilde kapatın, ardından cildin kenarlarına antiseptik uygulayın ve hayvanı tekrar ısıtma yastığına yerleştirin.
Hayvan tamamen iyileştiğinde. İskemi indüksiyonunu doğrulamak için her iki arka bacak hareketini gözlemleyerek nörolojik defisit belirtilerini kontrol edin. Foto tromboz öncesi ve sonrası kan akışındaki değişiklikler lazer doppler akış ölçer ile ölçülebilir.
Bu deneyde az önce gösterildiği gibi, ışık aydınlatmasından hemen sonra kan akışı bazal seviyeye kıyasla yaklaşık% 20'ye düştü, burada foto trombozun başlangıcındaki ve sonundaki omurilik kan damarlarının floresan görüntüleri gösteriliyor. İki dakikalık foto periyodudan sonra bir kan pıhtısı oluşumuna dikkat edin, bu da iskeminin indüksiyonunu düşündürür ve lazer doppler akış ölçer tarafından ölçülen azalmış kan akışı ile tutarlıdır. Bu rostral toko spinal kord transvers kesitleri serisinde, foto trombozdan üç gün sonra normal ve fototrombozun indüklediği merkez üssü, foto ile aydınlatılmış dokularda spinal kord doku hasarı ve hücre ölümünün varlığını gösteren belirgin bir şekilde ayrılmış bir infarktüs bölgesi izlenebilmektedir.
Gerçekten de, trombozdan üç gün sonra omurilik dokusunun immün boyanması, iskemik çekirdeğin gri maddesinde yeni uç pozitif nöronların kaybını ortaya çıkardı. İskemik çekirdek sınırında GFAP ekspresyonu artarken, IBA bir pozitif mikroglia ayrıca bir G OID morfolojisi sergiledi, ayrıca GFAP'de genel bir artış ile artmış bir IBA bir ekspresyonu ve spinal kord iskemisi sonrası penumbrada nöronal ölümü ve reaktif gliozu gösteren enfarktüs başına tüm bölgede IBA bir ekspresyonu sergiledi. Yaralı hayvanlarda foto trombozdan bir gün sonra engelli arka bacak hareketi gibi daha önemli fonksiyonel eksiklikler de gözlenmiştir.
Bu prosedürü takiben, omurilik iskemisinde aksonal dejenerasyon, rejenerasyon ve nöronal asetik kalsiyum sinyalinin rolleri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için iki fotomikroskopik gibi bir yöntem uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, T 10 RT 11 omurlarının sırt yüzeyinin nasıl inceltileceğini ve açıkta kalan arka spinal kan damarlarının nasıl aşındırılacağını iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Fototromboz, omurilikte fokal iskeminin indüklenip indüklemediğini görmek için kullanılan minimal invaziv ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu yöntem, farelerde omurilik yaralanması modeli olarak kullanılır. Bu teknik, araştırmacıların omurilik yaralanmasının etkilerini ve olası terapötik müdahaleleri incelemelerine olanak tanır.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Omurilik Yaralanması
- Iskemi Modelleri
Arka Plan
- Omurilik yaralanmaları önemli motor ve duyusal eksikliklere yol açabilir.
- Yaralanma ve iyileşme mekanizmalarını anlamak, tedavilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
- Fototromboz, bu süreçleri in vivo olarak incelemek için kontrollü bir yöntem sunar.
- Bu model, özellikle terapötik stratejilerin test edilmesi için yararlıdır.
Çalışmanın Amacı
- Fare omurilik iskemi modelinin tekrarlanabilirliğini geliştirmek.
- Omurilik yaralanmasının sonuçlarını değerlendirmek.
- Olası terapötik müdahaleler üzerinde araştırma yapmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Omurga T9'dan T12'ye kadar olan vertebraları ortaya çıkarmak için farenin sırt yüzeyinin cerrahi diseksiyonu.
- Yüksek hızlı bir matkap kullanarak T10 veya T11 vertebraların sırt yüzeyinin inceltilmesi.
- Kan damarlarını etiketlemek için retroorbital kök yoluyla fotoaktif bir boya uygulanması.
- Fototromboz indüklemek için arka omurilik damarlarının ışınlanması.
Ana Sonuçlar
- Omurilikte fokal iskeminin başarılı indüksiyonu.
- Nissl boyaması ve immünohistokimya kullanılarak yaralanma sonuçlarının değerlendirilmesi.
- Modelin tekrarlanabilirliği ve kullanım kolaylığının gösterilmesi.
- Omurilik yaralanmasının sinir dokusu üzerindeki etkileri hakkında içgörüler.
Sonuçlar
- Fototromboz, omurilik iskemi çalışmaları için etkili bir modeldir.
- Bu yöntem, yaralanma mekanizmalarının ayrıntılı bir şekilde araştırılmasını sağlar.
- Yeni terapötik yaklaşımların test edilmesi için potansiyel taşır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Photothrombosis-induced focal ischemia provides a reproducible mouse model for studying spinal cord ischemia mechanisms and evaluating neuroprotective drug efficacy. This model supports target validation and mechanistic de-risking in preclinical discovery by enabling controlled ischemia induction and longitudinal assessment of neuronal death, gliosis, and axonal pathology. It bridges discovery-stage hypothesis testing with translational biomarker exploration in live animals.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ischemic cell death pathways and functional target validation in spinal cord tissue.
- Operational Value: Supports biological de-risking through reproducible infarct formation and quantifiable neuron loss.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by modeling ischemia-driven secondary injury mechanisms relevant to clinical SCI.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated ischemic spinal cord tissue for downstream compound screening and biomarker analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization via consistent thrombus formation and infarct demarcation.
- Scalability: Enables platform reuse for testing multiple neuroprotective candidates across cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports exploration of axonal degeneration, regeneration, and calcium signaling using two-photon microscopy in live mice.
- Operational Value: Provides disease-relevant system for longitudinal monitoring of lesion evolution and repair processes.
- Translational Continuity: Connects ischemia mechanisms to functional outcomes like hind limb deficit assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery for target hypothesis testing, progresses to screening for compound efficacy, and supports translational research via live imaging and histological validation.
- Discovery Biology: Enables mechanistic interrogation of ischemia-induced neuronal death and reactive gliosis pathways.
- Screening: Delivers reproducible infarct models for quantitative assessment of neuroprotective compound effects.
- Analytics: Generates histological and imaging readouts (Nissl, GFAP, IBA1, laser Doppler flow) for condition comparison and efficacy ranking.
- Translational Research: Supports continuity from ischemia modeling to axonal pathology and calcium signaling studies in vivo.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized ischemia induction platform applicable across multiple therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reproducible ischemia modeling and cell death quantification.
- Operational Value: Standardized surgical and irradiation protocol ensures reproducibility across laboratories and timepoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by modeling clinically relevant secondary ischemia mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroprotective candidates based on infarct reduction and functional preservation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, vertebral thinning, and precise laser irradiation to avoid spinal cord damage.
- Needs instrumentation including high-speed drill, laser Doppler flow meter, fluorescence microscope, and retroorbital injection system.
- Demands standardization of anesthesia, saline perfusion, and light power settings (12% for 2 minutes) across operators.
- Adaptation considerations include vertebral level targeting (T10-T11) and vessel visualization consistency across mouse strains.
- Practical limitations include technical skill dependency for bone thinning and potential variability in thrombus formation if irradiation is inconsistent.
