Name: PCR ile Gün 30 Domuz Embriyolar Doğru ve Fenol Ücretsiz DNA cinsiyet tayini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Öğrenin, domuz embriyolarında fenol içermeyen DNA ekstraksiyonu ve PCR ile hızlı cinsiyet tayini yöntemini. Bu teknik, üreme fizyolojisi araştırmalarında güvenli ve maliyet etkin bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar işbirliği ve aşağıdaki araştırma fonu ajansı mali katkılarını kabul etmek istiyorum: Alberta Hayvancılık ve Et Ajansı Ltd., Domuz CRC, Alberta domuz, Hypor A Hendrix Genetik Firma ve NSERC CRSNG.

Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi ile ve Fakülte Hayvan Politikası ve Refah Kurulu onayı gereğince - Alberta Üniversitesi&#39;nden Hayvancılık, hamile sows gebelik ve embriyo 30 toplandı yaklaşık Gününde eğitilmiş personeli tarafından ötenazi uygulandı. işlemleri sırasında her zaman muayene eldivenleri kullanın. 1. Örnek Toplama ve Numune Depolama <ol><li> kansız bırakılarak, ardından tutucu cıvata kullanılarak ekmek öldürülür. Her ötenazi ekmek üreme yolları ve embriyolar toplamak için muayene eldiven giyin. Not: örnekler ve embriyo transferi hızlı toplama buz veya sıvı azot gibi mikrodizi ve qPCR gibi diğer moleküler işler için daha yüksek kalitede dokularda neden olur kuru. </li><li> Rahim incelemek ve yavaşça yatan rahim duvarından 21 kendi extraembryonic plasental membranların içindeki tüm embriyolar ayırın. Hiçbir anne doku kirlenme olduğundan emin olun. </li><li> Yenidendonma önce tüm canlı embriyoların kordon uzunluğu ve ağırlığı. </li><li> her embriyo toplayın ve hemen ek sıvı azot ile dondurma önce bir alüminyum folyo içinde tamamlamayı. </li><li> doğrudan -80 ° C derin dondurucuda sıvı azot dondurulmuş embriyolar transfer. </li></ol> 2. Öğütme Embriyolar <ol><li> numune sayısı için gerekli Numune No Tüm numune tüpleri (15 mi) etiketi analiz edilecek. </li><li> yarım dolu kuru buz ile ısı kabı doldurmak ve kuru buz içinde önceden etiketlenmiş örnek tüp yerleştirin. </li><li> Buz kabı kuru ° C derin dondurucuda -80 önceden soğutulmuş harç ve havan aktarmak için üst muayene eldiveni başka bir çift ile kış eldiven giyin. </li><li> kuru buz üzerinde harç içinde donmuş embriyo yerleştirin. </li><li> embriyo kapak ve ince bir toz haline tokmak ile öğütmek için yeterli bir sıvı azot dökün. </li><li> Bir MICR ile önceden etiketlenmiş numune tüpü embriyo toz transferiospatula (Şekil 1) ve -80 ° C derin dondurucuda tüp yerleştirin. </li><li> Her embriyo için temiz bir ön-soğutulmuş havan kullanın ve örnekler arasındaki çapraz kontaminasyonu engellemek için her bir embriyo öğütüldükten sonra muayene eldivenleri değiştirin. </li></ol> 3. Genomik DNA Hazırlama Sodyum hidroksit Yöntemi Modifiye kullanarak <ol><li> numune sayısı için gerekli etiket Tüm mikrosantrifüj tüpleri (1.5 mi), analiz edilecek. </li><li> elde edilen embriyo tozu içeren örnek tüplerini aktarın -80 ° C derin dondurucuda bir kapta kuru buz ile önceden başlamadan. </li><li> Her bir önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpüne 50 mM NaOH (sodyum hidroksit) ile 180 ul pipet. </li><li> 95 ° C&#39;ye kadar bir kuluçka öncesi ısı açın. </li><li> 50 mM NaOH çözeltisi ihtiva eden bir ön-etiketli mikrosantrifüj tüpüne Örnek borusundan embriyo tozun doğru miktarda (yaklaşık 5-10 mg) (Şekil 2) aktarmak için bir kürdan. </li><li> u çekinp aynı kürdan yavaş yavaş bir yapışkan, aşırı duygusal, beyaz, şeffaf benzeri bir madde (Şekil 3) DNA lizatı görselleştirmek için. </li><li> Beş dakika süre ile 95 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir inkübatör DNA lizat ile mikrosantrifüj tüpleri aktarın. Hemen buz dolu bir strafor kutu tüp aktarın. </li><li> doğrudan mikrosantrifüj tüpüne 1 M Tris-HCI 20 ul ilave edin ve tüp hafifçe dokunarak karıştırın. PH santrifüj önce yaklaşık 8.0 (Şekil 4) sağlamak için pH kağıdı kullanın. Not: Örnek hazırlıkları çok sayıda uğraşırken, rastgele pH&#39;ı kontrol etmek birkaç örnek almak kabul edilebilir. </li><li> çözülmemiş doku çöküntüsü ortadan kaldırılmaktadır oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde 2,000 xg DNA lisatı ile tüp santrifüjleyin. </li><li> Devri, yeni bir tüp içine, berrak yüzer 150 ul ya da 96 gözlü plakalar. Not: berrak DNA lizat PC şablon olarak kullanıma hazırR, reaksiyon ve iki hafta içinde 4 ° C&#39;de stabildir, ya da, bir yıl boyunca -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 4. Tasarım Sex-spesifik PCR primerler <ol><li> NCBI web sitesinden http://www.ncbi.nlm.nih.gov gelen Domuz seks belirleyici bölge Y (SRY) için katılım numaralarını (NM_214452.3) ve ve çinko parmak protein X&#39;e bağlı (ZFX) genleri (XM_005673501.1) elde /. </li><li> Kopyala ve bir online astar tasarım aracı bu NCBI erişim numaraları yapıştırın. Not: Uzunluk, Tm ve GC% olarak PCR ürün hacmi (bp), bilgisayar ekranında oluşturulur (Şekil 5) de dahil olmak üzere iyi primerler bilgileri. </li><li> Bu dizilerin yalnızca sırasıyla SRY ve ZFX (Şekil 6) X ve Y kromozomu üzerinde yer sağlamak için mevcut domuz genomik veri tabanında 104 karşı nükleotit Blast programı (BLASTN) kullanarak bu primerlerin özgüllük doğrula. </li></ol> Doğrudan DNA Lisatlar 5. genomik DNA, PCR <ol><li> kullanım15 ul PCR reaksiyonu için şablon olarak DNA, lizat yalnızca 1 | il. Not: 96 oyuklu plakalar PCR için bir yüksek veri akışı tarama yöntemi, bir çok kanallı pipet kullanarak benzer bir şekilde gerçekleştirilebilir. </li><li> İlk PCR için aşağıdakileri yapın: ticari olarak elde bilinen seks domuz genomik DNA 1 ul (0.5 ng) ekleyerek hiçbir şablon negatif kontrol ve pozitif kontroller için iki ek borular için bir PCR tüpü hazırlayın. Daha sonra, bir pozitif kontrol olarak, son başarılı cinsiyet tayini analizi bir örnek vardır ve cinsiyet tespiti için yeni bir PCR reaksiyonunda ile birlikte çalışır. </li><li> Herhangi bir HotStart hazır karışım PCR enzimi kullanın ve ekleyerek primerler tarafından ana karışımı hazırlamak ve PCR reaksiyonlarının toplam sayısına bağlı olarak ücretsiz su nükleaz. PCR Master Mix 14 ul önceden var olan bir PCR tüpü içerisine DNA lizat için 1 ul ekle. primerler ekleme gibi, iki cinsiyete spesifik genlerden primerlerin nihai konsantrasyon 15 | il PCR r, toplam 0.3 uM olduğunu,eaction. </li><li> termal siki üs cihazında Aşağıdaki PCR programı ayarlama: 3 dakika, 95 ° C 35 döngü 15 saniye uzatma adımı, ardından 65 ° C&#39;de 15 saniye tavlama aşamasına ve ardından bir 20 saniye Erime aşama 98 ° C, her 72 ° C&#39;de. Son bir adımda, 72 ° C&#39;de 1 dakika için reaksiyonlar inkübe ve cinsiyet belirlemek için jel elektroforezi doğrulama için PCR tüpü çıkarılması kadar 4 ° C&#39;de inkübe devam etmektedir. Not: PCR koşulları ve optimizasyon Malzemeleri Tablo belirtilen PCR kiti kılavuzuna göredir. </li><li> % 2 TBE agaroz jel hazırlanırken, toksik olmayan yeşil-floresan SYBR DNA jel leke uygun miktarda ekleyin. Not: mevcut değilse Ethidium bromür sera floresan leke ikame edilebilir. </li><li> PCR tüp içine yükleme boyası (10x) 1.5 ul ekleyin ve PCR reaksiyon tamponu yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın. </li><li> oyuk ve r içine örnek yüklenebilir 10 ulun uygun voltaj ayarlarıyla agaroz jel (boya bant kadar 100 V küçük jel cihaz, 150 V, 96 oyuklu jel aparatı jeli içinden yarım çalışır). </li><li> Gözlemleyin ve bir lazer tarayıcı kullanılarak floresan ışığı ayarı altında bantları yoğunlukları ayarlayın ve jel bir görüntü yakalamak. Not: Genel jel görüntüleyici etidyum bromür jel için ikame edilebilir. </li><li> Bir kadın olarak bir bant ve bir erkek olmak üzere iki bant (Şekil 7) ile embriyolar tanımlayarak domuz embriyoların cinsiyeti belirlemek. </li></ol>

<ol><li>Seidel, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Economics+of+selecting+for+sex%3A+the+most+important+genetic+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Economics of selecting for sex: the most important genetic trait.</a> Theriogenology. 59, 585-598 (2003).</li>
<li>Gutiérrez-Adán, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+consequences+of+sexual+dimorphism+during+pre-implantation+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Domest.+Anim%22%5BJournal%5D)">Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development.</a> Reprod. Domest. Anim. 41, Suppl 2. 54-62 (2006).</li>
<li>Rosenfeld, C. S., Roberts, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+diet+and+other+factors+affecting+offspring+sex+ratio%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review.</a> Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).</li>
<li>Gorecki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+ratio+in+litters+of+domestic+pigs+%28Sus+scrofa+f.+domestica+Linnaeus%2C+1758%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758).</a> Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).</li>
<li>Chen, Z. Y., Dziuk, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+initial+length+of+uterus+per+embryo+and+gestation+stage+on+prenatal+survival%2C+development%2C+and+sex+ratio+in+the+pig%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Influence of initial length of uterus per embryo and gestation stage on prenatal survival, development, and sex ratio in the pig.</a> J. Anim. Sci. 71, 1895-1901 (1993).</li>
<li>Vinsky, M. D., Novak, S., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Foxcroft, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+restriction+in+lactating+primiparous+sows+selectively+affects+female+embryo+survival+and+overall+litter%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Fertil.+Dev%22%5BJournal%5D)">Nutritional restriction in lactating primiparous sows selectively affects female embryo survival and overall litter.</a> Reprod. Fertil. Dev. 18, 347-355 (2006).</li>
<li>Cassar, G., King, W. A., King, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+sex+on+early+growth+of+pig+conceptuses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Influence of sex on early growth of pig conceptuses.</a> J. Reprod. Fertil. 101, 317-320 (1994).</li>
<li>Zudova, D., Rezacova, O., Kubickova, S., Rubes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+detection+in+porcine+embryos+using+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization.</a> Cytogenet Genome Res. 102, 179-183 (2003).</li>
<li>Hornak, M., Oracova, E., Hulinska, P., Urbankova, L., Rubes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+detection+in+pigs+using+comparative+genomic+hybridization%3A+from+the+oocytes+to+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy detection in pigs using comparative genomic hybridization: from the oocytes to blastocysts.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Handyside, A. H., Pattinson, J. K., Penketh, R. J., Delhanty, J. D., Winston, R. M., Tuddenham, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsy+of+human+preimplantation+embryos+and+sexing+by+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification.</a> Lancet. 1, 347-349 (1989).</li>
<li>Wilton, L. J., Shaw, J. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+single-cell+biopsy+and+cryopreservation+of+preimplantation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Feri.+Steril%22%5BJournal%5D)">Successful single-cell biopsy and cryopreservation of preimplantation mouse embryos.</a> Feri. Steril. 51, 513-517 (1989).</li>
<li>Peura, J. M., Turunen, M., Janne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+sex+determination+assay+for+bovine+preimplantation+embryos+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction.</a> Theriogenology. 35, 547-555 (1991).</li>
<li>Rao, K. B., Pawshe, C. H., Totey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+determination+of+in+vitro+developed+buffalo+%28Buhalus+buhalis.%29+embryos+by+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Sex determination of in vitro developed buffalo (Buhalus buhalis.) embryos by DNA amplification.</a> Mol. Reprod. Dev. 36, 291-296 (1993).</li>
<li>Herr, C. M., Matthaei, K. I., Petrzak, U., Reed, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Y-chromosome-detecting+ovine+embryo+sexing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">A rapid Y-chromosome-detecting ovine embryo sexing assay.</a> Theriogenology. 33, 245(1990).</li>
<li>Fajfar-Whetstone, C. J., LaneRayburn, A., Schook, L. B., Wheeler, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+determination+of+porcine+during+preimplantation+embryos+via+y-chromosome+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sex determination of porcine during preimplantation embryos via y-chromosome specific DNA sequences.</a> Animal Biotechnology. 4, 183-193 (1993).</li>
<li>Pomp, D., Good, B. A., Geisert, R. D., Corbin, C. J., Conley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+identification+in+mammals+with+polymerase+chain+reaction+and+its+use+to+examine+sex+effects+on+diameter+of+day-10+or+-11+pig+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos.</a> J. Anim. Sci. 73, 1408-1415 (1995).</li>
<li>Aasen, E., Medrano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+the+ZFY+and+ZFX+genes+for+sex+identification+in+humans%2C+cattle%2C+sheep+and+goats%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats.</a> Biotechnology (N Y). 8, 1279-1281 (1990).</li>
<li>Oliver, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+feed+intake+in+lactating+primiparous+sows.+II.+Effects+on+subsequent+litter+sex+ratio+and+embryonic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil.+Dev%22%5BJournal%5D)">Restricted feed intake in lactating primiparous sows. II. Effects on subsequent litter sex ratio and embryonic gene expression.</a> Reprod Fertil. Dev. 23, 899-911 (2011).</li>
<li>Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R. L., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29, 52-54 (2000).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 43, 610-614 (2007).</li>
<li>Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+different+dietary+energy+sources+during+folliculardevelopment+on+subsequent+fertility+of+cyclic+gilts%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts.</a> Animal. 8, 293-299 (2014).</li>
<li>Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L. Prenatal programming of postnatal development in the pig. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoxcroft%2C+GR+%22Control+of+Pig+Reproduction+VIII%22">Control of Pig Reproduction VIII</a>. Rodriguez-Martinez, , Nottingham University Press. 212-213 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Domuz embriyolar DNA seks yazarak ilgili mevcut protokollerin en erken evre öncesi implantasyon aşamasında 15,16 için uygundur. Biz başarıyla Geç gebelik sırasında domuz embriyo tarama için uygun bir protokol geliştirmiştir. Daha önceki çalışmalarda 6,18 embriyoların içindeki gelişim aşamalarında çalışmalara dayanarak, bu protokol, daha güvenli ve daha düşük maliyetli olarak kabul edilir. Bu protokol, aynı zamanda, bir 96-yuvalı plaka içine bir DNA lizatlarının aktarıla...

yerli domuz, insan ve hayvan sektörlerinde gelişme, genetik ve beslenme temel bir araştırma konusu haline gelmiştir. insan araştırma için biyomedikal model olarak domuz potansiyel fizyolojik benzerlikler isnat edilebilir. Hayvancılık, cinsiyet oranı manipülasyon seçimi ve genetik iyileştirme programları 1 etkinliğini artırabilir. Bireysel embriyolar sexing dahil ancak erken embriyo gelişimi 2 sırasında genotip, epigenetik ve cinsel dimorfizm X inaktivasyonu ile sınırlı değildir, birçok deneysel araştırmalarda kullanılan temel bir araçtır. Farelerde yapılan çalışmalar, anne beslenme ve diğer faktörler, cinsiyet dengesizliği 3 neden olabileceğini düşündürmektedir. Domuzlarda, cinsiyet oranı dengesizlik nedenleri baba cins 4, rahim kapasitesi 5 ve sow metabolik durumunu 6 içerir. embriyolar ve yavrularına gözlenen farklılıklar se etkilemiş olabilir berixual dimorfizm araştırmacılar araştırma ile ilgili kararınızı vermeden önce embriyo cinsiyet ve cinsiyet oranları farkında olmalıdır. gelişme 30. günde domuz embriyolar sexing verimli araçlar ve protokollerin geliştirilmesi burada ele alınacaktır. seks yazarak çeşitli yöntemler model organizmaların ve hayvancılık genetik çalışmalar için geliştirilmiştir. Özellikle hayvancılık, erkek ve kadın erken embriyolar belirlenmesi ıslah programları için genetik seçimi geliştirmek için çok yaygın bir uygulamadır. Giemsa 7 veya yoğun floresan 8,9 teknikleri kullanılarak domuz Karyotipleme erken embriyolar seks yazım için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu metodlar zaman alıcı ve hızlı ve doğru bir şekilde embriyo sayıda taranması için uygun değildir. En etkili seks yazım metodu, ısı sabit DNA polimeraz ve bir çift primer kullanılarak DNA amplifikasyon. PCR yöntemi ile DNA cinsiyet tayini O, daha özel bir hızlı ve duyarlı birnly hücresel malzemelerin bir dakika miktarda gerektirir. İlk PCR tabanlı embriyo cinsiyet tayini insanlarda 10 üzerinde gerçekleştirilir ve daha sonra fareler 11, sığır 12, manda, koyun 13 14 pre-implantasyon embriyoları oldu. Domuz, erken DNA seks yazarak yöntemi Y-kromozomu spesifik DNA primerleri 15 tek çifti üzerinden pre-implantasyon embriyoları için kurulmuştur. Bununla birlikte, cinsiyet tespiti için en yaygın PCR primerleri, bir erkek spesifik SRY 16 ve X ve Y kromozom 17 hem de yer alan bir çinko parmak geninin olmayan seks ayırt bölgenin Y kromozom seçilmiştir. Daha sonra, bu primer, bir çinko-parmağı genin sadece X kromozomu tespit etmek için primerler geliştirilmiş özgüllük bu çalışmada gün 30 embriyo cinsiyet belirleme uygulanmıştır. domuz pre-implantasyon embriyoları genomik DNA proteinas tamponu için sağlam bir blastosist maruz bırakılarak elde edilebilire K 16 veya bireysel erken bölünme birkaç hücre biyopsi alarak 15 embriyolar ve direkt PCR için bunları kullanarak. Bununla birlikte, domuz kanı, saç, dokular ya da boyut olarak birkaç santimetre üzerinde büyük konseptus DNA salgılanmasının etkin bir şekilde proteinaz K yöntemiyle yapılmaz. Bu malzemeler için DNA ekstraksiyon yöntemleri zaman alıcı fenol / kloroform protokolleri 6 ya da pahalı sütun tabanlı kitleri 18 kullanılarak kurulmuştur. potansiyel olarak toksik kimyasalların kullanımını önlemek için, ucuz, kolay ve fenol içermeyen DNA ekstraksiyon yöntemleri geliştirmek için bir eğilim vardır. Fare 19 ve zebra balığı 20 dokularından elde edilen kalite genomik DNA izolasyonu için protokol Bu tür sıcak sodyum hidroksit ve tris (Hotshot) kullanılarak kurulmuştur. Bu çalışma, PCR seks için Hotshot değiştirilmiş ve yeniden tasarlanmış dubleks primer çiftleri Günün hücre lizatları 30 domuz embriyolar ile doğrudan yazarak DNA elde etmek için bir protokol sağlaryüksek doğruluk.

<table><tbody><tr><td>KAPA HiFi HotStart Hazır Karışım PCR kiti&nbsp;</td><td>KAPABiosystems</td><td>KR0370</td><td>diğer Hot Start Taq polimeraz optimizasyondan sonra kullanılabilir</td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA Jel Leke</td><td>Ömrü Teknolojileri</td><td>S33102</td><td>Etidyum bromür, SYBR Safe</td></tr><tr><td>Pig dişi ve erkek genomik DNA'sı</td><td>Zyagen</td><td>GP-160-F1 & GP-160-M5</td><td>Bilinen cinsiyet DNA'sının dokularından elde edilen pozitif kontroller kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9500 lazer tarayıcı</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9969-43</td><td>diğer görüntüleme sistemi kullanılabilir</td></tr><tr><td>Ücretsiz Yumuşak Nitril Muayene Eldivenleri</td><td>WWR</td><td>89038-270</td><td>başka herhangi bir muayene eldiveni kullanılabilir</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit, katı ve nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 359 -212</td><td>Moleküler Biyoloji Sınıfı</td></tr><tr><td>Eppendorff DNA LoBind Tüpleri, 1.5 ml, PCR temiz</td><td>Eppendorff</td><td>0030 108.051</td><td>ısıya dayanıklı</td></tr><tr><td>ThermoStat plus</td><td>Eppendorff</td><td>22670204</td><td>95 & # 176 için inkübatör olarak kullanın; C, ısıtıcıyı kullanmanıza gerek yok</td></tr><tr><td>Kürdan</td><td>Bunzl Plc</td><td>75200815</td><td>Herhangi bir yuvarlak ahşap kürdan kullanılabilir - kaliteli ahşap</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj 5417R/5417C</td><td>Eppendorff</td><td>22621807</td><td>Bu modelin üretimi durduruldu. Ancak daha yeni bir model daha kullanılabilir</td></tr>: <tr><td>Microspatula</td><td>Fisher</td><td>SDI28540115</td><td>her seferinde kullanımdan önce otoklavlanmıştır.</td></tr></tbody></table>

pcr ile gün 30 domuz embriyolar doğru ve fenol Ücretsiz dna cinsiyet tayini

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

domuz prenatal programlama içine Araştırma gelişen embriyonun veya fetüsün cinsiyet gelişim sonucunu etkilemeye göstermiştir. Bu nedenle, bir embriyonun cinsiyetini belirleme yeteneği özellikle erken gelişimi ile ilgili birçok deneyler gereklidir. Bu protokol, PCR ile kullanım için domuz genomik DNA ucuz, hızlı ve toksik olmayan hazırlanmasını ortaya koymaktadır. Gün 30 embriyolar insanca mevcut protokol için Kurumsal Hayvan Politikası ve Refah Komiteleri tarafından oluşturulan kurallara göre toplanan gerekir. Bu PCR bazlı cinsiyet tayini tekniği bütün embriyo hazırlanması sadece önceden soğutulmuş bir havan ve havan tokmağı kullanılarak ince bir toz halinde donmuş embriyo taşlama içerir. PCR kalitede DNA alkalin liziz reaktifi sıcak inkübasyon uygulayarak embriyo tozu küçük bir miktar serbest bırakılmaktadır. Daha sonra, DNA solüsyonu nötralizasyon tamponu ile karıştırılmış ve PCR için doğrudan kullanılmıştır. İki primer çiftleri DETEC için oluşturulacakyüksek doğruluk ve özgüllük ile X- kromozomunun Y kromozomu (SRY) ve ZFX bölgenin bölgesini belirleyen t özgü seks. aynı protokol gün daha önce başka bir uzun embriyolar (gün 14 gün 10) uygulanabilir 30. otomasyon ve yüksek için uygun hale embriyo çok sayıda tarama Ayrıca, bu protokol 96 dönüştü plakalı yapılabilir verim seks yazarak.

PCR ile 345 DNA Lizatlar taramadan cinsiyet tayini temsili bir sonuç Şekil 7&#39;de gösterilen ve Tablo 1&#39;de özetlenmiştir. Şekil 7&#39;de görüldüğü gibi, 65 ° C &#39;de primer tavlama ısısı farklı örnekleri arasında, bu PCR protokolü içindeki yoğunluk ve esas amplikon boyutları üretilmesi (Şekil 5) uygun bir durumdur. <p class="jove_content" fo:keep-t...

Bu protokol, fenol kloroform ekstraksiyonu ve DNA kolon saflaştırması olmadan bir embriyonun toz haline getirilmesinden sonra PCR yöntemini kullanarak 30. gün domuz embriyosunun cinsiyetini belirlemek için doğru, ucuz, hızlı ve toksik olmayan bir yöntemi tanımlar.

PCR ile Gün 30 Domuz Embriyolar Doğru ve Fenol Ücretsiz DNA cinsiyet tayini

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Bu prosedürün genel amacı, her bir embriyodan elde edilen fenol içermeyen DNA ve PCR reaksiyonu için iki çift cinsiyete özgü primer kullanarak, 30 günlük domuz embriyolarının cinsiyetini doğru bir şekilde belirlemektir. Bu yöntem; uterus kapasitesi ve diş domuzun metabolik durumu dahil olmak üzere maternal faktörlerin cinsiyet oranı üzerindeki etkisinin yanı sıra çeşitli paternal faktörler gibi, çiftlik hayvanlarında üreme fizyolojisi ile ilgili çeşitli sorulara cevap verme potansiyeline sahiptir.Bu tekniğin avantajı, DNA saflaştırma sırasında fenol-kloroform gibi toksik kimyasalların veya pahalı kolonların kullanılmamasıdır. Öyleyse, uygulamaya geçelim. Bu yöntemin görsel gösterimi, numune hazırlığı kadar önemlidir.Adımları öğrenmek kolaydır ancak semptom çapraz kontaminasyonunu önlemek için ayrıntılara özel özen gösterilmesi önemlidir. Metne uygun olarak embriyo örneklerini -80 °C dondurucuya aktarın. Örnek tüplerini, analiz edilecek örnek sayısı kadar gerekli olan örnek kimlikleri (ID) ile etiketleyin.Termal bir kabın yarısını kuru buzla doldurun ve önceden etiketlenmiş bir örnek tüpünü kuru buzun içine yerleştirin. Kışlık eldivenlerin üzerine muayene eldivenleri giymiş haldeyken, önceden soğutulmuş havan ve havan tokmağını eksi seksen derece santigrat dondurucudan kuru buz kabına aktarın. Ardından, dondurulmuş bir embriyoyu kuru buz üzerindeki havanın içine yerleştirin ve embriyoyu kaplayacak miktarda sıvı nitrojen dökün.Ardından, ince bir toz haline getirmek için havan eli kullanın. Mikrospatul yardımıyla embriyo tozunu önceden etiketlenmiş bir numune tüpüne aktarın ve tüpü -80 °C dondurucuya yerleştirin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için numuneler arasında muayene eldivenlerini değiştirerek, her bir ek embriyonun öğütme ve dondurma işlemini tekrarlayın.Analiz edilecek örnek sayısı için gerekli olan tüm mikrosantrifüj tüpleri etiketledikten sonra, embriyo tozu içeren örnek tüplerini -80 °C dondurucudan kuru buz içeren bir kaba aktarın. Önceden etiketlenmiş her bir mikrosantrifüj tüpüne 180 µL 50 mM sodyum hidroksit pipetleyin. Bir inkübatörü 95 °C'ye önceden ısıtın.Bir kürdan yardımıyla, örnek tüpünden yaklaşık beş ila on miligram embriyo tozunu önceden etiketlenmiş sodyum hidroksit tüpüne aktarın. DNA lizatını yapışkan beyaz, şeffaf benzeri bir madde olarak gözlemlemek için kürdanı çözeltiden yavaşça kaldırın. DNA lizatı içeren örnekleri beş dakika boyunca 95 °C'lik inkübatöre yerleştirin, ardından tüpü hemen buzla doldurulmuş yalıtımlı bir kaba aktarın.Ardından, tüplerin içine doğrudan 20 µL 1 M tris-hidroklorür ekleyin ve hafifçe karıştırmak için tüplere vurun. pH kağıdı ile pH'ın yaklaşık 8.0 olduğundan emin olun. Daha sonra, çözünmemiş doku kalıntılarını uzaklaştırmak için tüpleri 2000 ×g'de ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca santrifüj edin.Üstteki berrak süpernatantın 150 microlitresini yeni tüplere veya bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve iki haftaya kadar dört degrees celsius'ta saklayın.Veya, bir yıla kadar -20 °C'de saklanabilir. Bu protokolün başarısı, X ve Y kromozomları üzerindeki primerlerinizi ne kadar spesifik tasarladığınıza bağlıdır. Peki, primerlerin X ve Y kromozomları üzerinde olduğundan nasıl emin olursunuz?Bunu göstermenin en iyi yolu NCBI Map Viewer'ı kullanmaktır. PCR için cinsiyete özgü primerler tasarlamak için, pore sign cinsiyet belirleyici bölge Y (SRY) ve çinko parmaklı protein X-bağlı (ZFX) için erişim numaralarını elde etmek üzere NCBI web sitesini kullanın. Erişim numaralarını kopyalayıp çevrimiçi bir primer tasarım aracına yapıştırın.Primerlerin güncel pore sign genomik veri tabanı 104'e karşı özgüllüğünü doğrulamak için nucleotide blast veya blast N kullanın. Dizileri girmek için; SRY yalnızca X kromozomunda, ZFX ise yalnızca Y kromozomunda yer alır. DNA lizatları ile PCR gerçekleştirmek için herhangi bir hot start ready mix PCR enzimi kullanın ve 15 µL'lik bir PCR reaksiyonunda, final konsantrasyonu 0.3 µM olacak şekilde iki cinsiyete özgü primer ekleyerek bir master mix hazırlayın.Reaksiyonların ilk kez çalıştırılması için, şablon içermeyen negatif kontrol için bir PCR tüpü ve ticari olarak temin edilmiş cinsiyet belirleyici genomik DNA'nın bir mikrolitresini ekleyerek pozitif kontroller için iki ek tüp hazırlayın. Sonraki PCR döngüleri için, pozitif kontrol olarak son başarılı cinsiyet analizinden alınan bir mikrolitre örneği ekleyin. Bir termosiklatörde aşağıdaki PCR programını ayarlayın ve PCR'ı gerçekleştirin.PCR sonrası örnekleri doğrulamak için, cyber DNA jel boyası veya etidyum bromür içeren %2'lik TBE agaroz jel hazırlayın. Örnekleri jele yükleyip çalıştırmadan önce, her birine 1,5 µL 10X yükleme boyası ekleyin. Bant yoğunluklarını floresan ışık altında gözlemleyip ayarlayın ve jelin görüntüsünü kaydedin.Tek bantlı embriyolar dişi, iki bantlı embriyolar ise erkek olarak tanımlanır. Burada, PCR ile taranan 345 DNA lizatından elde edilen cinsiyet belirleme işleminin temsili bir sonucu gösterilmektedir. Benzer yoğunluk ve öngörülen amplikon boyutlarının elde edilmesi için, optimal primer bağlanma sıcaklığı olan 65 °C, burada gösterilen primerlerin TM değerinden biraz daha yüksektir.Burada SRY ve ZFX'in iki amplifiye ürünü sunulmaktadır. Dişi embriyolardan alınan lizat örnekleri, X kromozomu üzerinde yer alan ZFX geninden yalnızca 506 baz çifti uzunluğunda tek bir DNA fragmanı bandı oluşturur. Tüm erkek embriyolar, SRY için 400 baz çifti ve ZFX için 506 baz çifti uzunluğunda, eşit yoğunlukta iki DNA fragmanı oluşturur.Burada gösterildiği üzere, 345 embriyo taramasının ardından DNA lizatlarında herhangi bir PCR reaksiyon inhibisyonu görülmemiştir. Sadece üç bireyin cinsiyeti belirlenememiştir ve dişi embriyoların yüzdesi erkeklere göre hafifçe daha yüksek çıkmıştır. Öğütme işleminden PCR'ın gerçekleştirilmesine kadar bu teknik uzmanlaşıldığında, yaklaşık on embriyonun işlenmesi yaklaşık bir saat sürmektedir.Bu teknik uygulanırken, özellikle embriyo tozunun tüplere aktarılması sırasında çapraz kontaminasyondan kaçınmak önemlidir. Bu prosedürün ardından, beslenmenin ve enfeksiyöz hastalıkların cinsiyetler arasındaki genomik ve epigenetik etkilerini incelemek için DNA metilasyonu, mikroarray ve dizileme gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, reprodüktif fizyoloji ve hayvan bilimi alanındaki araştırmacıların çeşitli çiftlik hayvanı türlerinde cinsel dimorfizm ile ilgili araştırmalar yürütmesinin önünü açacaktır.Bu videoyu izledikten sonra, cinsiyete özgü primerlerin nasıl tasarlanacağı, embriyolardan DNA'nın nasıl izole edileceği ve DNA lizatları kullanılarak PCR reaksiyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Kuru buzla çalışmanın oldukça tehlikeli olduğunu unutmayın; bu nedenle uygun önlemleri alın, eldiven ve koruyucu gözlük kullanın.

accurate-and-phenol-free-dna-sexing-of-day-30-porcine-embryos-by-pcr

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Bu protokol Fare preimplantasyon embriyolar soy özellikleri çalışma protein ekspresyonu in situ analiz kantitatif, tek hücreli gerçekleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. blastosist toplanması için gerekli işlemler, proteinlerin immunofluorescent algılama tüm montaj, bir konfokal mikroskop ve nükleer segmentasyon ve görüntü analizi örneklerin görüntüleme açıklanmıştır.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

Mikroarray teknolojisi, transkriptlerin genom çapında kantitatif ölçümüne ve gen ekspresyon profiline izin verir. Bu nedenle, bu protokol, düşük miktarda toplam RNA kullanmanın fizibilitesini göstermek için 7. gün sığır embriyolarını kullanan iki renkli özel yapım bir sığır dizisinde optimize edilmiş bir teknik prosedür sağlar.

Transcriptome Profil In-vivo Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Burada, Yunus sperm toplama, dondurma ve sığır yumurta kullanarak kapaklı tüp bebek performansı için başarılı bir şekilde kullanılmıştır protokolleri mevcut.

Şişe burunlu yunus (Tursiops truncatus) sperm: koleksiyon, dondurma ve kapaklı In Vitro fertilizasyon

Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Bu protokolde, domuza özgü astarlar tasarlanmış, plazmid içeren domuz spesifik DNA parçaları inşa edilmiş ve nicellik için standart eğriler oluşturulmuştur. Türe özgü astarlar kullanılarak, domuzdan fareye hücre nakli modellerinde ve domuzdan maymuna arter yama transplantasyonu modellerinde cpsDNA qPCR ile ölçüldü.

Knenotransplantasyon Modelinin KanLarında Dolaşan Domuza Özgü DNA'nın Ölçülmesi

Bu çalışma, embriyo biyopsisini önleyen ve NGS kullanılarak kromozom ploidi tanımlamasını sağlayan, harcanan kültür ortamını kullanan insan embriyolarının kromozom taraması için bir protokol bildirmektedir. Bu makale, kültür ortamının hazırlanması, tüm genom amplifikasyonu (WGA), yeni nesil dizileme (NGS) kütüphanesinin hazırlanması ve veri analizi dahil olmak üzere ayrıntılı prosedürü sunmaktadır.

İnsan Preimplantasyon Embriyolarının Harcanan Kültür Ortamı Kullanılarak Kromozom Taraması: Örnek Toplama ve Kromozomal Ploidi Analizi

Erken gelişim, maternal kalıtsal ürünlere bağlıdır ve bu ürünlerin çoğunun rolü şu anda bilinmemektedir. Burada, tek bir nesilde anne-etki fenotiplerini tanımlamak için CRISPR-Cas9 kullanan bir protokol tanımladık.

Maternal Crispantlarla Erken Gelişimde Annelik İfade Edilen Genlerin Rolünün Belirlenmesi

Burada, CRISPR RNP Zygotes Elektroporasyonu (CRISPR-EZ) adı verilen genetiği değiştirilmiş farelerin verimli bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış basit bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, elektroporasyon yoluyla düzenleme reaktiflerini embriyolara %100'e yaklaşan bir verimlilikle teslim eder. Bu protokol, memeli embriyolarındaki nokta mutasyonları, küçük genomik eklemeler ve delesyonlar için etkilidir.

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

Bu makale, tek hücrelerin ve çekirdeklerin dizilimi için gastrulasyon yapan fare embriyolarının yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları için bir boru hattı oluşturur.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Öğrenin, domuz embriyolarında fenol içermeyen DNA ekstraksiyonu ve PCR ile hızlı cinsiyet tayini yöntemini. Bu teknik, üreme fizyolojisi araştırmalarında güvenli ve maliyet etkin bir alternatif sunar.

PCR ile Gün 30 Domuz Embriyolar Doğru ve Fenol Ücretsiz DNA cinsiyet tayini

Daha fazla video keşfet