PCR ile Gün 30 Domuz Embriyolar Doğru ve Fenol Ücretsiz DNA cinsiyet tayini

Bu prosedürün genel amacı, her embriyodan elde edilen fenol içermeyen DNA'yı kullanarak 30. gün domuz embriyolarının cinsiyetini doğru bir şekilde belirlemektir. Ve bir PCR reaksiyonu için iki çift cinsiyete özgü primer. Bu yöntem, anne faktörlerinin rahim kapasitesi ve dişi domuzun metabolik durumu dahil olmak üzere cinsiyet oranı üzerindeki etkisi ve çeşitli baba faktörleri gibi çiftlik hayvanlarında üreme fizyolojisi ile ilgili çeşitli soruları yanıtlama potansiyeline sahiptir.

Bu tekniğin avantajı, fenol-kloroform gibi toksik kimyasallar veya DNA saflaştırması sırasında pahalı sütunlar içermez. Öyleyse, gösteriyi yola çıkaralım. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, semptom hazırlığı kadar önemlidir.

Adımların öğrenilmesi kolaydır, ancak semptomların çapraz kontaminasyonunu önlemek için ayrıntılara özel dikkat gösterilmesi önemlidir. Metne göre embriyo örneklerini negatif seksen santigrat derece dondurucuya aktarın. Numune tüplerini, analiz edilecek numune sayısı için gereken numune kimliği ile etiketleyin.

Termal bir kabı yarıya kadar doldurmak için kuru buz kullanın ve kuru buzun içine önceden hazırlanmış bir numune tüpü yerleştirin. Kışlık eldivenler giyerken, üstte bir çift muayene eldiveni ile, önceden soğutulmuş havan toplarını ve havaneli negatif seksen santigrat derece dondurucudan kuru bir buz kabına aktarın. Daha sonra, kuru buzun üzerine harcın içine donmuş bir embriyo yerleştirin, ardından embriyoyu kaplayacak kadar sıvı nitrojen dökün.

Ve ince bir toz haline getirmek için bir havaneli kullanın. Bir mikrospatula kullanarak embriyo tozunu önceden hazırlanmış bir numune tüpüne aktarın ve tüpü negatif seksen derecelik dondurucuya yerleştirin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için numuneler arasında muayene eldivenlerini değiştirerek her ek embriyonun öğütülmesini ve dondurulmasını tekrarlayın.

Analiz edilecek numune sayısı için gerekli olan tüm mikrosantrifüjlenmiş tüpleri etiketledikten sonra, embriyo tozu içeren numune tüplerini negatif seksen santigrat derece dondurucudan bir kuru buz kabına aktarın. 180 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksiti önceden etiketlenmiş her bir mikrosantrifüjlenmiş tüpe pipetleyin. Bir inkübatörü doksan beş santigrat dereceye ısıtın.

Bir kürdan ile, yaklaşık beş ila on miligram embriyo tozunu bir numune tüpünden önceden etiketlenmiş bir sodyum hidroksit tüpüne aktarın. DNA lizatını yapışkan beyaz, şeffaf benzeri bir madde olarak görselleştirmek için kürdanı solüsyondan yavaşça kaldırın. DNA lizatı olan numuneleri beş dakika boyunca doksan beş santigrat derece inkübatöre aktarın, ardından tüpü hemen buzla dolu yalıtımlı bir kaba aktarın.

Daha sonra, yirmi mikrolitre bir molar tris-hidroklorürü doğrudan tüplere ekleyin ve hafifçe karıştırmak için tüplere hafifçe vurun. pH kağıdı ile pH'ın yaklaşık 8.0 olduğundan emin olun. Daha sonra, tüpleri iki bin G'de santrifüjleyin ve çözünmemiş doku kalıntılarını gidermek için iki dakika oda sıcaklığında tutun.

150 mikrolitre üst şeffaf süpernatanı yeni tüplere aktarın. Veya, 96 kuyulu bir plaka. Ve iki haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın.

Veya bir yıla kadar eksi yirmi santigrat derece. Bu protokolün başarısı, astarınızı X ve Y kromozomu üzerinde ne kadar spesifik tasarladığınıza bağlıdır. Peki X ve Y kromozomunda olduklarından nasıl emin olabilirsiniz?

NCBI Map Viewer'ı kullanmak, bunu göstermenin en iyi yoludur. PCR için cinsiyete özgü primerler tasarlamak için, gözenek işareti cinsiyet belirleme bölgesi Y.Or SRY ve çinko parmak proteini X'e bağlı veya ZFX için erişim numaralarını almak üzere NCBI web sitesini kullanın. Erişim numaralarını kopyalayıp çevrimiçi bir astar tasarım aracına yapıştırın.

Primerlerin mevcut gözenek işareti genomik veritabanına 104 karşı özgüllüğünü doğrulamak için nükleotid blast veya blast N kullanın. Dizileri girmek için, sırasıyla SRY ve ZFX için yalnızca X ve Y kromozomunda bulunur. DNA lizatları ile PCR gerçekleştirmek için, herhangi bir sıcak başlatmaya hazır karışım PCR enzimi kullanın ve 15 mikrolitrelik bir PCR reaksiyonunda 0.3 mikromolar nihai konsantrasyonda cinsiyete özgü iki primer ekleyerek bir ana karışım hazırlayın.

Reaksiyonları ilk kez çalıştırarak, şablonsuz negatif kontrol için bir PCR tüpü ve ticari olarak elde edilen bir mikrolitre seks gözenek işareti genomik DNA'sı ekleyerek pozitif kontroller için iki ek tüp hazırlayın. Sonraki PCR turları için, pozitif kontrol olarak son başarılı cinsiyetlendirme analizinden bir mikrolitre numune ekleyin. Aşağıdaki PCR programını bir termodöngüleyicide kurun ve PCR'yi gerçekleştirin.

PCR'den sonra numuneleri çeşitlendirmek için, siber DNA jel boyası veya etidyum bromür içeren %2'lik bir TBE agaroz jeli hazırlayın. Jele yüklemeden ve çalıştırmadan önce numunelere 1,5 mikrolitre 10X yükleme boyası ekleyin. Floresan ışığı altında bant yoğunluklarını gözlemleyin ve ayarlayın ve jelin bir görüntüsünü yakalayın.

Bir bantlı embriyoları dişi ve iki bantlı erkek olarak tanımlayın. Burada, PCR ile taranan 345 DNA lizatından cinsiyet tayini için temsili bir sonuç gösterilmektedir. Optimum astarın 65 santigrat derece tavlama sıcaklığı, benzer yoğunluk ve tahmin edilen ampilcon boyutları oluşturmak için burada gösterilen primerlerin TM'sinden gözle görülür şekilde daha yüksektir.

SRY ve ZFX'in iki güçlendirilmiş ürünü burada sunulmaktadır. Dişi embriyolardan alınan lizat örneği, X kromozomu üzerinde bulunan ZFX geninden yalnızca tek bir bant 506 bazlı çift DNA parçası üretir. Tüm erkek embriyolar, SRY için 400 baz çifti ve ZFX için 506 baz çifti eşit yoğunlukta iki DNA parçası üretir.

Burada gösterildiği gibi, DNA lizatları 345 embriyo tarandıktan sonra herhangi bir PCR reaksiyonu inhibisyonu göstermedi. Sadece üç birey cinsiyetlendirilmedi ve dişi embriyoların yüzdesi erkeklerden biraz daha yüksekti. Bu tekniğe öğütmeden PCR'nin uygulanmasına kadar ustalaştıktan sonra, yaklaşık on embriyonun işlenmesi yaklaşık bir saat sürer.

Bu tekniği yaparken, özellikle embriyo tozunu tüplere aktarırken çapraz kontaminasyonu önlemek önemlidir. Bu prosedürü takiben, cinsiyetler arasında beslenme ve bulaşıcı hastalıkların genomik ve epigenetik etkilerini araştırmak için DNA metilasyonu, mikroarray ve dizileme gibi diğer yöntemleri kullanabiliriz. Bu tekniğin geliştirilmesi, üreme fizyolojisi ve hayvan bilimi alanlarındaki araştırmacıların çeşitli hayvan türlerinde cinsel dimorfizm ile ilgili araştırmalar yapmasının önünü açacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, cinsiyete özgü primerlerin nasıl tasarlanacağını, embriyolardan DNA'nın nasıl soyutlanacağını ve DNA lizatlarını kullanarak PCR reaksiyonunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Kuru buzla çalışmanın oldukça tehlikeli olduğunu unutmayın, bu nedenle uygun önlemi alın, eldiven ve gözlük takın.