Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

At türlerinde adrenal aktivite, kortikosteron metabolitleri için dışkı analizi ile değerlendirilebilir. Yöntem, hem evcil hem de serbest dolaşan atlarda uzun vadeli kalıpları değerlendirmek için invaziv olmayan bir seçenek sunar. Bu protokol, ilgili enzime bağlı immünolojik testi ve ilişkili biyokimyasal doğrulamayı tanımlar.

Bu prosedürün genel amacı, fekal glukokortokoid metabolitlerinin ekstraksiyonu ve analizi yoluyla atlarda adrenal aktivitenin non-invaziv olarak nasıl değerlendirilebileceğini göstermektir. Bu yöntem, hayvancılık protokollerinin evcil atlar üzerindeki fizyolojik etkilerine, Afrika zebralarının vahşi popülasyonlarına kadar bakarak, refah değerlendirmesi alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hem evcil hem de serbest dolaşan atlarda uzun süreli adrenal aktiviteyi ölçmek için invaziv olmayan bir seçenek sunmasıdır.

Deney günü, oda sıcaklığında çözüldükten sonra, dışkı örneklerini her bir numune torbası içinde karıştırarak manuel olarak homojenize edin. Daha sonra, her numune için temiz bir tartım teknesinde bir mikro terazide uygun miktarda dışkı ölçün ve numuneleri ayrı sekiz mililitrelik cam şişelere aktarın. Daha sonra, her numuneyle beş mililitre %90 metanolü suda karıştırın ve numuneleri gece boyunca oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.

Ertesi sabah, numuneleri girdaplayın ve döndürün. Santrifüjlemenin sonunda, metanol fraksiyonlarını ayrı ayrı 16 x 125 milimetre cam tüplere boşaltın. Daha sonra tüpleri kısa bir süre 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin, ardından metanolün hava altında bir çeker ocakta buharlaştırılmasını izleyin.

Metanolün tamamı dağıldığında, dışkı ekstraktlarını bir mililitre %100 metanol içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra ekstraktları ayrı ayrı 12 x 75 milimetre polipropilen tüplere aktarın, tüpleri kapatın ve numuneleri analizlerine kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Analize başlamadan önce, 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına oyuk başına kaplama tamponunda seyreltilmiş 50 mikrolitre poliklonal kortikosteron CJM006 antiserum yüklemek için 50 mikrolitrelik pipet ucuna sahip tekrarlayan bir pipet kullanın.

Daha sonra plakayı bir plaka kapatıcı ile örtün ve antiserumu gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, analize başlamadan hemen önce, plakayı beş kez yıkama solüsyonu ile yıkamak için otomatik bir mikrotitre plaka yıkayıcı kullanın. Daha sonra, spesifik olmayan bağlanma ve sıfır kuyucukları, kuyu başına 50 mikrolitre enzime bağlı immünolojik test veya EIA tamponu, uygun kortikosteron konsantrasyonlarına sahip standart kuyucuklar ve EIA tamponunda seyreltilmiş dışkı özü örnekleri ile deney kuyucukları yükleyin.

Son numuneyi yükledikten sonra, hemen her bir oyuğa EIA tamponunda seyreltilmiş 50 mikrolitre yaban turpu perodixase konjugatı ekleyin ve mikrotitre plakasını karanlıkta oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, plakayı beş kez yıkama solüsyonu ile yıkayın. Daha sonra numuneleri, karanlıkta oda sıcaklığında taze hazırlanmış, oda sıcaklığında substrat başına 100 mikrolitre ile inkübe edin ve plakanın bir spektrofotometrede 405 nanometrede periyodik olarak okunmasını sağlayın.

Sıfır kuyuların optik yoğunluğu 0.8 ila 1.0'a ulaştığında inkübasyon tamamlanmış kabul edilir. Paralellik için bir biyokimyasal doğrulama yapmak için, ideal olarak birkaç kişiden şüpheli yüksek ve düşük hormon konsantrasyonlu örneklerden alınan havuzlanmış dışkı ekstraktları üzerinde seri bir seyreltme gerçekleştirin. Ardından, örnekleri az önce gösterildiği gibi ÇED üzerinde çalıştırın.

Dışkı ekstraktlarının seri seyreltmeleri standart eğriye paralel bir yer değiştirme eğrisi verdiğinde ve doğrusal regresyon sonuçları 0.9'dan büyük bir R karesi, 0.5'ten büyük bir eğim ve 05'ten küçük bir P gösterdiğinde bir paralellik elde edildiği kabul edilir. Girişim için bir biyokimyasal doğrulama yapmak için, 200 mikrolitre seri seyreltilmiş standardı, paralellik tahlili ile belirlendiği gibi% 50 bağlanmada seyreltilmiş 200 mikrolitre uygun havuzlanmış dışkı özütü ile çivileyin. Ardından örnekleri gösterildiği gibi ÇED üzerinde çalıştırın.

EIA analizinin ardından, gözlemlenen konsantrasyonu eksi sıfır numunenin arka plan konsantrasyonu ile beklenen konsantrasyona karşı çizin. Standartlara seyreltilmiş havuzlanmış dışkı ekstraktının eklenmesi beklenen miktarı önemli ölçüde değiştirmezse ve doğrusal regresyon sonuçları, 0.9'dan büyük R kare, bire yakın bir eğim ve 05'ten küçük P verirse, hiçbir girişim elde edildiği düşünülmez. Biyolojik bir doğrulama yapmak için, az önce gösterildiği gibi ÇED'de zorlu bir olaydan önce ve sonra çıkarılan numuneleri çalıştırın.

Biyolojik doğrulama, ÇED'in doğrulanması için kritik bir adımdır ve zorlu bir olaydan sonra glukokortikoid metabolitlerinde önemli bir artış gözlendiğinde elde edildiği kabul edilir. Grafik A ve B'deki veriler, bir kortikosteron standart eğrisi ile paralellik göstererek yetişkin erkek ve dişi evcil atların biyokimyasal doğrulamasını göstermektedir. Havuzlanmış dışkı özütü ile kortizol standart eğrisi arasında paralellik olmadığı için kortizol EIA ile biyokimyasal doğrulama elde edilemedi.

Zorlu erkek ve dişi evcil atlardan elde edilen bu veriler, bu hayvanlarda izolasyon seviyesi arttıkça fekal kortikosteron konsantrasyonu arttığından biyolojik doğrulamayı göstermektedir. Gerçekten de, izole edilmiş konut durumundaki atlar, diğer tüm konut tasarımlarına kıyasla önemli ölçüde daha yüksek fekal kortikosteron seviyeleri sergiledi. Bu nedenle, tükürük veya plazmadaki hormon konsantrasyonlarını değerlendirmek genellikle doğal hormona bakmamızı içerir, ancak dışkı materyalinde değerlendirdiğimizde, bu ürünün parçalanmasına ve bu hormonun metabolik son ürünlerine bakıyoruz.

Gerçekten de, dışkı örneklemesi, tükürük veya plazma tarafından yansıtılan tek nokta yerine, zaman içinde havuzlanmış bir glukokortooid konsantrasyonu sunar. Bu, uzun süreli, kronik veya mevsimsel adrenal aktiviteyi ölçmek için daha uygun hale getirir. Bu nedenle, dışkı örneği toplama hayvan için invaziv olmadığından, çok sayıda doğal ve deneysel durumda at adrenal aktivitesini izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır.

ÇED'i çalıştırırken, mikrotitre plakasını yükleme süresini 10 dakikanın altına indirmek önemlidir, çünkü daha uzun süreler kaymaya neden olur. Mükerrer numunelerin %10'dan daha az bir varyasyon katsayısına sahip olmasını ve kontrollerin sırasıyla %10 ve %15'lik bir test içi ve tahliller arası katsayı varyasyonuna sahip olmasını sağlamak da önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, fekal glukokortokoid metabolitlerinin nasıl çıkarılacağı, bu ekstraktların bir enzim immünolojik testinde nasıl analiz edileceği ve ayrıca gerekli doğrulama adımlarının nasıl gerçekleştirileceği konusunda gerçekten iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.