Tümör Hücre Göçü ve İnvaziv Olmayan İlaçların Hastaya Özel Etkilerinin İncelenmesi İçin Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültürü Modeli

Günümüzde glioblastoma (GBM) 'nin ex vivo modelleri, insan tümörü invazyonunun fizyolojik olarak ilgili çalışması için optimize edilmemiştir. Burada, taze insan GBM dokusundan alınan organotipik dilim kültürlerinin üretimi ve bakımı için bir protokol sunuyoruz. Zaman atlamalı mikroskopi ve kantitatif hücre göç analiz tekniklerinin bir açıklaması sağlanmıştır.

Bu prosedürün genel amacı, birincil insan glioblastoma hücrelerinde invaziv göç davranışlarını gözlemlemek ve analiz etmektir. Bu yöntem, nöroonkoloji alanında, hastalığın ilerlemesi ve tedavi yanıtlarında hastaya özgü farklılıkların altında yatan fenotipik ve moleküler özellikler gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, glioblastomun in vivo doku mimarisini ve hücresel heterojenliğini korurken birincil hücrelerin doğrudan manipülasyonuna izin vermesidir.

Kuyucuk başına bir mililitre dilim kültürü bakım ortamı içeren altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna boş PTFE kültür ekleri yerleştirmek için steril forseps kullanarak başlayın. Tüm ekler eklendiğinde, plakayı 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş su ceketli bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Daha sonra, tümör dokusu parçalarını buz gibi soğuk işleme ortamı içeren bir Petri kabına yerleştirin ve yapışan kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için dokuyu üç kez taze ortamla nazikçe yıkamak için bir pipet kullanın.

Üçüncü yıkamadan sonra, tümör parçalarını yaklaşık üçe üç x 10 milimetrelik şeritler halinde kesmek için neşter kullanın, bağlı damarları dikkatlice çıkarın ve nekrotik veya koterize dokudan kaçının. Dokunun tamamı kesildiğinde, iki küp santimetrelik plastik gömme kalıbına beş ila yedi milimetre 37 santigrat derece sıvı agaroz ekleyin ve agarozu bir dakika boyunca bir buz yatağında soğutun. Uzun eksen dikey olarak yönlendirilmiş olarak agarozun içine iki ila dört doku şeridi yerleştirin ve dokuları yerleştirildikten sonra iki ila beş dakika daha buz üzerinde bırakın.

Agaroz katılaştıktan sonra, agarozu kalıptan nazikçe çıkarmak için kalıbın kenarlarını bir neşter ile kesin. Ve agaroz bloğunu bir vibratom numune plakasına sabitlemek için bol miktarda siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın. Yapıştırıcı sertleştiğinde, agaroz bloğunu buz gibi soğuk işleme ortamına daldırın ve vibratom rezervuarı içindeki ortama %5 CO2, %95 O2 karışımını köpürtmek için kesilmiş steril bir plastik pipet kullanın.

Vibratom dilimi kalınlığını 300 ila 350 mikron olarak ayarlayın ve bıçak ilerleme hızını ve bıçak genliğini doku kıvamına ve vibratom özelliklerine göre ayarlayın. Dilimleri elde edildikleri gibi buz gibi soğuk işleme ortamı içeren bir Petri kabına aktarmak için paslanmaz çelik bir mikro spatula kullanarak planlanan deneysel analize göre uygun sayıda dilim elde edin. Tüm dilimler elde edildiğinde, her dilimi tek bir PTFE ekine aktarmak için mikro spatulayı kullanın.

12 ila 24 saatlik bir inkübasyondan sonra, hücre kültürü inkübatöründe 15 dakika boyunca taze dilim kültür bakım ortamı içeren yeni bir altı oyuklu plakayı dengeleyin. Ardından, her bir parçayı kenardan kavramak için steril forseps kullanın ve ekleri yeni altı oyuklu plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Yedi ila 10 günlük kültür arasında, her doku diliminin yüzeyine damla damla beş ila 10 mikrolitre GFP eksprese eden retrovirüs ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun.

Sinyal belirgin olduğunda, bir mililitre taze dilim ortamını cam tabanlı bir tabakta dengeleyin ve ekleri tabağa aktarmak için steril forseps kullanın. Çanağı, konfokal bir mikroskobun 37 derecelik,% 5 CO2 sızdırmaz mikroskop aşamalı üst inkübatörüne yerleştirin. Hücre göçünün üç boyutlu zaman çözümlü görüntülerini yakalamak için tek veya çoklu fotonlu görüntüleme ile birlikte uzun bir çalışma mesafesi, 10x hava hedefi kullanın.

Dilim kenarı ile dokunun merkezi arasında yeterli yoğunlukta floresan etiketli tümör hücresi bulunan uygun bir alanı bularak dilimi mikroskopla görselleştirin. Ardından, görüntüleme yazılımının çok boyutlu analiz modunda, Z yığınının merkezini, görüntülenecek tüm konumlar görünür bir floresan hücresel sinyal içerecek şekilde ayarlayın ve her Z yığını alımı için yeterli bir süre ayarlayın. Başlamak için ImageJ'de bir Z yığını dosyası açın ve Görüntü, Yığınlar ve Z Projesi'ni seçin.

Analiz için Z yığınının ilk ve son zaman dilimini seçin ve maksimum yoğunluk projeksiyonu veya MIP işleme oluşturmak için projeksiyon türü olarak Maksimum Yoğunluk'u seçin. Serideki her zaman noktası için aynı anda MIP oluşturmak için Tüm zaman dilimleri kutusunu işaretleyin. Görüntülenen her bölgede yakalanan her Z yığını görüntü kümesinden bir MIP oluşturun.

Eklentiler menüsünden MTrackJ'yi açın ve Ekle düğmesine tıklayın. İlgilenilen tümör hücresindeki hücre gövdesi merkeziyetini manuel olarak tanımlamak için, hücrenin görsel olarak yaklaşık merkez noktasına tıklayın. Her hücre için benzersiz bir iz oluşturmak için görüntü serisinin her zaman diliminde hücre gövdesi konumunu ayırın ve sonraki hücrenin hücre gövdesi konumlarını sırayla işaretleyin.

Belirli bir tümör mikro bölgesinde bir hücre popülasyonu izlendikten sonra, tüm hücre izi koordinatlarını dışa aktarmak ve dosyaları daha sonra analiz etmek üzere xls formatında kaydetmek için ölçüm işlevini kullanın. Son olarak, tümör istilasının kantitatif analizlerini yapmak için bir hücrenin göç yolu boyunca her nokta için kaydedilen koordinatları kullanın. Organotipik glioblastoma dilimleri, psödopalizaz nekrozu ve mikroglia'nın 15 güne kadar sürdürülmesi de dahil olmak üzere, kültür boyunca orijinal tümör dokusu ile bir uyum gösterir.

Hipoksik koşullar altında, dilimler hızlı bir fizyolojik yanıt oluşturur ve vasküler endotelyal büyüme faktörünün ortama salınmasını indükler, bu süreç in vivo olarak glioblastoma mikroçevresinde bol miktarda meydana gelir. Hızlandırılmış görüntü GFP eksprese eden tümör hücrelerinin kantitatif ölçümü, örneklerdeki tümör bölgeleri boyunca glioblastoma hücrelerinin göç hızının ve yönlülüğünün hesaplanmasına olanak tanır. Bir dilim kültürü içinde mikrogliadaki iç içe geçmiş ancak morfolojik olarak farklı hareketli tümör hücrelerinin göçünün izlenmesi, hücre tipine özgü hareket modellerini ortaya çıkarır.

Dilim bölgelerinin yaklaşık her 10 dakikada bir görüntülenmesi, hücre bölünmesi geçiren tümör hücrelerinin hızlandırılmış görüntülerini kaydetmek için yeterli bir zamansal çözünürlük sağlar. Örneğin, burada, üç saatlik bir zaman dilimi içinde, göç için durakladıklarında, mitozu tamamladıklarında ve yavru hücrelerinde gecikmeden göçü yeniden başlattıklarında yakalanan bir çift bölünen hücre var. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa 90 dakika içinde tamamlanabilir.