Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme Ex Vivo Fare Kulak Cilt

Bu yeni deneysel protokolün genel amacı, tamamen farklılaşmış mekanosensoriyel sinir terminallerinin işlevini araştırmak için fare kulağındaki kıl foliküllerinin erişilebilirliğini göstermektir. Bu yöntem, sinaptik benzeri veziküllerin mekanik duyumdaki rolü gibi mekanosensoriyel sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin iki ana avantajı, hızlı olması ve sayısız canlı, tamamen farklılaşmış mekanosensoriyel sinir terminallerine kolay optik erişim sağlamasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, foliküllere zarar vermeden cilt ayrımı elde etmek ve kıkırdağı yeterince temizlemek ile mücadele edebilir. Temel tekniği göstermenin yanı sıra, burada sinir terminali fonksiyonunun hayati bir bölümünün kalsiyum bağımlılığına bakarak bir deney örneğini de göstereceğiz. 50 milimetre silikon kaplı bir tabağı Liley'nin solüsyonu veya başka bir fizyolojik tuzlu su ile doldurun.

Solüsyonu her 15 dakikada bir yenileyin veya sabit bir perfüzyon kullanın. Genç yetişkin bir farenin kafasını makas kullanarak kestikten sonra, tabana yakın dış kulakları, yoğun saç çizgisinin hemen üzerine çıkarın ve kulak kepçesini tabağa aktarın. Şimdi, ince böcek iğneleri kullanarak kenarlar boyunca içbükey tarafı aşağı bakacak şekilde bir kulağı sabitleyin.

Daha sonra, künt diseksiyon kullanarak açıkta kalan arka cildi dikkatlice soyun. 3 Numara forseps kullanarak merkezi arka cildi kavrayın ve başka bir forseps ile kulak tabanındaki cilt ile kıkırdak arasındaki boşluğu delin. Forsepsleri boşluk içinde bir yandan diğer yana nazikçe çalıştırın, ön ve arka cilt katmanlarını kademeli olarak ayırın.

Sistematik olarak merkezi kıkırdak boyunca ince kıkırdaksız kenarlara doğru hareket edin. Bu pratik gerektirecektir. Arka cildi çıkardıktan sonra, dermal tarafı yukarı bakacak şekilde ön cildin yanına sabitleyin.

Her iki cilt preparasyonundaki kıkırdak çıkarıldıktan sonra, saç foliküllerinin tabanını kaplayan köpüklü fibroelastik kıkırdak tabakasını çıkarın. Bu dokuyu nazikçe soyun, koparın ve ovalayın. Bu aynı zamanda ustalaşmak için pratik yapacaktır.

Çok azını çıkarmak boyayı ve görselleştirmesini engellerken, çok fazla çıkarmak sinir terminallerine zarar verir. Genç bir fare kullanmak, ön ve arka cilt katmanları arasındaki yapışmayı ve alttaki kıkırdağın çıkarılmasının zorluğunu en aza indirir. Bunların her ikisi de başarılı lekelenme görme olasılığını artıracaktır.

Her deri preparatı, replikant sayısını en üst düzeye çıkarmak ve kullanılan hayvanları en aza indirmek için tepeden tabana kadar ikiye bölünebilir. Bu bölüm, dokuların FM1-43 ile nasıl boyanacağını açıklar, ancak konsantrasyonlara uygun ayarlama ile bu sınıftaki diğer stiril piridinyum boyalarının çoğuyla çalışmalıdır. Bu prosedürü minimum ortam ışığı seviyelerinde gerçekleştirin.

Başlamadan önce, preparat başına 3 mililitre için uygun gazla doldurulmuş fizyolojik tuzlu su içinde yeterince taze 10 mikromolar FM1-43 yapın. Her hazırlığı, 2 mililitre uygun tuzlu su ile birlikte silikon kaplı 35 milimetrelik ayrı bir kaba koyun. Kalsiyum ve baryumun boya alımını sürdürme yeteneğini karşılaştırmak için, bu noktadan itibaren ayrı kaplarda inkübe edin.

Bazılarını normal Liley'nin 2 milimolar kalsiyumuna, diğerlerini ise baryumun kalsiyumun yerini aldığı Liley'ye koyun. Daha sonra, açık tabak hazırlıklarını 30 santigrat derece su banyosunda hafifçe batırılmış bir platforma yerleştirin. Su derinliği, dokuları tabağa dökülmeden ısıtmak için yeterli olmalıdır.

Her yemeğin içine, müstahzarları saniyede yaklaşık 10 kabarcık hızında gazlamak için silikon tabana ince bir gaz hattı sabitleyin. Ayrıca, FM1-43 solüsyonlarını ve 100 mililitre boya içermeyen salini sıkıca kapatılmış şişelerde ısıtın. Her şeyin 30 santigrat dereceye kadar dengelenmesine izin verin ve 30 dakika sonra, uygun ısıtılmış çözeltiyi kullanarak doku üzerindeki boya içermeyen salini değiştirin.

30 dakika daha kuluçkaya yatırın. İnkübasyondan sonra, boya içermeyen salini dökün ve müstahzarın etrafında kalan sıvıyı hızlı ve dikkatli bir şekilde kurulayın. Açıkta kalan dermal yüzeylere dokunmamaya dikkat edin.

Preparatları su banyosuna geri koyun ve gaz hatlarını baştan sona yerinde tutun. Şimdi 2 ila 3 mililitre kalsiyum veya baryum içeren ılık boya çözeltisi ekleyin. 40 dakika sonra, içselleştirilmiş boyanın yeniden salınmasını önlemek için prosedürün geri kalanı için dokuları oda sıcaklığına getirin.

Şimdi, içselleştirilmemiş boyayı üç aşamada çıkarın: İlk olarak, etiketleme solüsyonunu dökün ve dokuları hızlı bir şekilde oda sıcaklığında tuzlu su ile üç kez hızlı bir şekilde durulayın ve ardından kalan boyanın çoğunu yüzey zarlarından ayırmak için 30 dakika inkübe etmelerine izin verin. Son olarak, preparatı uygun şekilde kalsiyum veya baryum salin içinde yapılmış sülfonatlı bir b-siklodekstrin türevi ile şelatlayarak, açıkta kalan zarların dış broşürüne yapışan kalıcı boyayı çıkarın. Böylece kalan tüm boya dokuların içinde olacaktır.

Şelatlamadan sonra, müstahzarları uygun taze boya içermeyen tuzlu suya geri koyun ve bulaşıkların dışını kağıt mendil ile iyice kurulayın. Ardından, bunları mümkün olan en kısa sürede görüntüleyin. Minimum ortam ışığı altında çalışmaya devam edin.

Görüntülemeden önce, bir stereo mikroskop kullanarak, otomatik floresan yayacak ve görüntüleri kirletecek yüzey kalıntılarını temizleyin. Ardından, çanağı standart bir floresan filtre seti ile dik bir epifloresan mikroskobu altına yerleştirin. Daha sonra, preparat sinir terminallerini rahatça bulmak için yeterince aydınlatılana kadar nötr yoğunluklu filtreler kullanarak uyarma ışığı yoğunluğunu azaltın.

Tam aydınlatma, sinir terminallerini oldukça hızlı bir şekilde öldürür. Bulunduktan sonra, 10x kuru objektif veya 20x suya daldırma objektifi kullanarak etiketli mızrak şeklinde terminallerin görüntülerini yakalayın. 1/2 ila 1 saniye arasında bir kamera entegrasyon süresi kullanarak ışık yoğunluğunu ve pozlama süresini en aza indirin.

Her preparat için, kulak kepçesi derisinin tabanının kesik kenarından en uzak kenardan başlayarak ve bu kenar boyunca çalışarak, her bir folikülü sırayla görüntüleyerek yaklaşık 20 mızrak şeklinde uç görüntüleyin. Aynı folikülü iki kez görüntülemeden veya açıkça hasar görmüş folikülleri görüntülemeden kesik kenara paralel olarak hafifçe örtüşen alanlarda çalışın. Marjinal şeridi tamamladıktan sonra, kulak kepçesinin tabanına doğru bir alan genişliği hareket ettirin ve işlemi ters yönde tekrarlayın.

Analiz, metin protokolünde açıklanmıştır. Kalsiyum içeren tuzlu su içinde etiketlenmiş folikülleri gösteren ilk yemeği görüntüledikten sonra, folikülleri baryum içeren tuzlu su içinde görüntüleyin. Bu şekilde devam edin.

Kalan kontrol ve deney dokularının görüntülenmesinin zamanla eşleştiğinden emin olun, çünkü etiketlemeden sonra boya daha sonra kurucu SLV geri dönüşümünün ekzositoz kolu tarafından tekrar serbest bırakılacaktır. Tipik bir kulak kepçesi preparatında, saç folikülleri floresan olmadan transillüminasyon altında kolayca görülür, bu da preparatın gofret inceliğinde doğasını ve bu mekanosensoriyel terminallere sağladığı göreceli erişilebilirlik kolaylığını gösterir. Epifloresan altında, her bir saç folikülünü çevreleyen etiketli mızrak şeklinde terminaller açıkça görülür ve tipik olarak sağlam spontan FM1-43 alımını gösterir.

Noktalama deseni, terminalin uzunluğu boyunca cilde dik bir optik düzlemde gözlemlenen terminalleri yansıtır. Bu yöntemin birçok uygulamasından biri ekzositoz kinetiği çalışmasıdır. Beklendiği gibi, boya alımı vezikül geri dönüşümünden kaynaklanıyorsa, üst panellerde etiketli bir terminalin kendiliğinden lekelenme olduğu görülür.

Güçlü bir ekzositoz uyarıcısı olan alfa-latrotoksin uygulandıktan sonra, alttaki iki panelde görüldüğü gibi doğal leke giderme işlemi hızlanır. Videoda görüldüğü gibi bir diğer uygulama ise endositozun kalsiyum bağımlılığını incelemektir. Hem kalsiyum hem de baryum içeren tuzlu sularda mızrak şeklinde terminaller için belirgin boya alımı görülmüştür.

Video sırasında etiketleme görülen terminalin floresan yoğunluğunun ölçülmesinde, boya alımında önemli bir fark bulunmadı. Bu, endositozun baryum ve kalsiyum tarafından eşit derecede iyi desteklendiğini gösterir. Prosedürün diğer kulak preparatları üzerinde daha fazla tekrarlanması bu sonucu test edecektir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, tüm bu protokol ve görüntüleme iki buçuk saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, küçük fareler kullanmayı, hızlı bir şekilde incelemeyi ve gereken ışık yoğunluğunu en aza indirmek için maksimum derecede karanlığa adapte olmayı unutmamak önemlidir. Bu yöntem fikrini, aslen yakın bir meslektaşı ve şimdi emekli olan profesör Clarke Slater ve yüksek lisans öğrencisi Michael Caine tarafından geliştirilen bir yöntemden uyarladık.

Onlara kas iğciğindeki mekanosensasyonda sinaptik benzeri veziküllerin olası rolünden bahsettiğimizde, ancak FM1-43'ten daha iyi bir görselleştirme yöntemine duyulan ihtiyaçtan bahsettiğimizde. Bu prosedür aynı zamanda farmakoloji ve elektrofizyoloji gibi diğer yöntemlerle birlikte de kullanılabilir. Daha sonra sinaptik benzeri vezikül geri dönüşümünün nasıl düzenlendiğini ve bunun mekanosensoriyel uçların duyarlılığı ile nasıl ilişkili olduğunu inceleyebiliriz.