İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Bu protokol, yüksek verim, saflık ve canlılığa sahip yetişkin fare kardiyomiyositlerinin tekrarlanabilir izolasyonu ve uzun süreli kültürü için adım adım bir yöntemi açıklar.

Bu prosedürün genel amacı, kültür ve adenoviral vektör transdüksiyonu için canlı primer yetişkin fare kardiyomiyositlerini izole etmektir. Bu yöntem, kardiyovasküler araştırma alanındaki bazı önemli sorulara cevap verecektir. Özellikle, yetişkin memeli kardiyomiyositlerinin hücre döngüsüne girmesini ve tamamlanmasını neyin önlediğini ayarlayabiliriz.

Bu tekniğin ana avantajı, uzun süreli kültür için yüksek miktarda canlı yetişkin fare kardiyomiyositi elde edilebilmesidir. Kalp ekstraksiyonu ve kanülasyon prosedürleri zor olduğu için bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, ancak hızlı ve verimli bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Kalbi çıkarmak için, yetişkin bir fareyi intraperitoneal enjeksiyon ile vücut ağırlığının gramı başına beş uluslararası heparin birimi ile tedavi ederek başlayın.

Heparinin kalbe dolaşmasına izin vermek için 20 dakika bekleyin. Ardından, anestezi uygulandıktan sonra, ayak parmağı sıkışması ve kornea reflekslerine yanıt verilmediğini onaylayın ve hayvanın uzuvlarını bir ameliyat platformuna bantlayın. Yüzde 70 etinolün liberal uygulamasıyla kesi bölgesini sterilize edin ve ardından saçı bir laboratuvar mendiliyle kurulayın.

Daha sonra, sternumun hemen altındaki cildi kaldırmak için forseps kullanın ve cilt ve periton boyunca yanal bir kesi yapın. Daha sonra, kanama durdurucular kullanarak, göğüs kafesini sternumdan nazikçe kaldırın ve insizyonu eksenel olarak V şeklinde uzatmak için küçük diseksiyon makası kullanın. İlk kaburgayı kesin ve diyaframı her iki taraftan delin, göğüs kafesini kanama durdurucularla birlikte kaldırılmış halde tutun.

Küçük İris makası kullanarak diyaframı tamamen kesin. Daha sonra göğüs kafesini rostral olarak geri çekmek için hemostatları kullanın ve kesiyi göğüs kafesinden her iki tarafta eksenel olarak doğru hızlı ama dikkatli bir şekilde uzatın. Göğüs kafesinin orta kısmını tamamen geri çekin, dokuyu yerinde tutmak için bağlı kanama durdurucuları yerleştirin ve perikardları ince forseps ile çıkarın.

Ardından, kalbi nazikçe kaldırmak ve bağlı damarları ve arterleri kesmek için kavisli forseps kullanın. Kalbi buz gibi soğuk perfüzyon tamponunda yıkayın, ardından kalbi 215 mikronluk küçük bir ağ parçasına aktarın. Miyokard kasılmalarını yavaşlatmak için buz gibi soğuk perfüzyon tamponu ekleyin ve çanağı bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.

İnce iris makası kullanarak, herhangi bir erişim kardiyak olmayan dokuyu kesin. Daha sonra aortu brakiyosefalik arterin yakınından geçirin ve açıklığa kabarcık veya doku kalıntılarının girmesine izin vermemeye dikkat edin. Kalbi kanüle etmek için, çözelti 18 gauge kanülün açıklığının üzerine çıkana kadar Petri kabını buz gibi soğuk perfüzyon tamponu ile doldurun.

Daha sonra, kanülün ucunu ve aortu tamponun yüzeyinin altında tutarak, iğne ucu aort kapağının hemen distaline gelene kadar aortu kanül üzerine kılıflayın. Önceden bağlanmış 7-0 ipek sütürü, dikiş iğne ucunun hemen üzerine gelene kadar kanülasyon iğnesinin şaftından aşağı kaydırın ve düğümü ince forseps ile sıkın. Birincinin hemen üzerine ikinci bir sütür yerleştirin.

Daha sonra, koroner vaskülatürden 0.5 mililitre perfüzyon tamponu enjekte edilene kadar şırıngayı yavaşça bastırın. Şırıngayı çıkardıktan sonra kanülü perfüzyon çıkış portuna takın. Perfüzyonun sonunda, kalbi kanülden çıkarmak için forseps kullanın ve kalbi boş bir Petri kabına yerleştirin.

İnce İris makası kullanarak, ekstra ventriküler dokuyu hızlı bir şekilde kesin ve ventrikülleri perfüzyon tamponu içeren yeni bir Petri kabında yıkayın. Yıkadıktan sonra, ventrikülleri kuru bir Petri kabına aktarın ve steril bir başlığa yerleştirin. Perfüzyon sisteminin ısı ceketinden 7.5 mililitre sindirim tamponu toplayın ve 2.8 mikrolitre bir molar kalsiyum klorür ekleyin.

Çözeltiyi ters çevirerek karıştırın. Daha sonra ventriküllere iki ila üç mililitre kalsiyum klorür takviyeli sindirim tamponu ekleyin. İnce forseps kullanarak, parçaların çoğu bir milimetre küpten daha küçük olana kadar ventriküler dokuyu hızlı bir şekilde trikterleştirin ve kalan kalsiyum klorür takviyeli sindirim tamponunu ayrışmış dokulara ekleyin.

Parçaları hafifçe çalkalayarak karıştırın. Ve onları 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte inkübe edin ve yeterli sayıda kardiyomiyosit salınana kadar her iki dakikada bir sürekli çalkalama ile inkübe edin. Ardından çanağı laminer akış başlığına geri koyun ve dokuyu nazikçe ayırmak için bir transfer pipeti kullanın.

Steril eldiven giyerek, 215 mikronluk ağı bir koni şeklinde katlayın ve 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerinde tutun. Doku bulamacını ağ üzerine pipetleyin ve süzüntüsün tüpe akmasına izin verin. Ardından 7,5 mililitre önceden ısıtılmış durdurma tamponu ile yıkayın.

Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir koniğe aktarın ve hücrelerin 15 dakika boyunca yerçekimi ile yerleşmesine izin verin. Ardından, hücrelerin üzerinde yalnızca 50 ila 100 mikrolitre çözelti kalana kadar süpernatanı dikkatlice çıkarmak için yeni bir transfer pipeti kullanın. Hücrelere 10 mililitre önceden ısıtılmış dengelenmiş kültür ortamı ekleyin ve hafifçe ters çevirerek karıştırın.

Son olarak, 15 dakikalık başka bir oda sıcaklığında inkübasyondan sonra, süpernatanı yerleşmiş hücrelerden çıkarmak için yeni bir transfer pipeti kullanın, ta ki sadece 50 ila 100 mikrolitre ortam kalana kadar. İzolasyondan hemen sonra, kardiyomiyositler, sağlam sarkomerler ve parlak alan aydınlatması altında keskin bir dış zar ile çoğunlukla çubuk şeklinde bir görünüm korur. Alfa aktinin gibi kardiyomiyosit spesifik sarkomerik belirteçler için immün boyama, belirgin bir sarkomerik bantlama paterni ortaya çıkarır.

Kültürde birkaç gün sonra, kardiyomiyositler yuvarlak bir morfoloji alır. Bir ila iki hafta içinde, canlı kardiyomiyositler substrata yapışır ve yayılmaya başlar. Bu GFP pozitif kardiyomiyositlerde gözlendiği gibi adenovirüs ile transdüksiyon, 48 ila 72 saat içinde güçlü bir gen ekspresyonu elde etmek için kullanılabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, koroner damar sistemini verimli bir şekilde doldurmak için hava kabarcıkları içermeyen güvenli bir kanülasyon elde etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, yetişkin memeli kardiyomiyositleri neden hücre bölünmesine dirençlidir gibi soruları yanıtlamak için immün boyama veya canlı görüntüleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Adenovirüs ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle ikinci sınıf bir biyogüvenlik kabininde çalışmak gibi uygun önlemlere uyulmalıdır.