Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

Burada, kanser metastazında pulmoner alveoler makrofajların fonksiyonlarını incelemek için model ve yaklaşımı açıklıyoruz. Bu hücrelerin metastazdaki rolünü göstermek için, alveolar makrofajın klodronat lipozomlarla tükenmesi ile birlikte meme kanserinin sinjenik (4T1) modeli kullanıldı.

Bu deneylerin genel amacı, meme kanserinin singenaik bir modeli kullanarak pulmoner alveoler makrofajların kanser metastazındaki rolünü belirlemektir. Bu yöntem, tümör immünolojisi ve kanser metastazı alanlarında, örneğin akciğerlerin neden en yaygın hedeflerden biri olduğu gibi hepatojenik kanser metastazı gibi bazı önemli sorulara cevap verebilir. Bu yöntemin en büyük avantajı, pulmiyoer alveolar mikrofajların çok spesifik bir yöntemle çok iyi bilinen meme kanseri modelini kullanmasıdır.

Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Surya Kumari Vadrevu olacak. Tümör hücresi enjeksiyonu gününde, önce traş edilmiş, anestezi uygulanmış bir fareyi cerrahi ped üzerine yerleştirin. Daha sonra, 100 mikrolitre PBS'deki beşinci tümör hücrelerini bir kez 10 ila beşinci tümör hücresini, 29 gauge iğne ile donatılmış sıfır nokta beş mililitre insülin şırıngasına aspire edin.

Ardından, ikinci ve üçüncü meme ucunun yakınındaki cildi kaldırmak için başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın ve iğneyi derinin altına, üçüncü meme ucunun hemen altındaki meme yağ yastığına yerleştirin. Deri altında bir kabarcık oluşturmak için hücreleri yavaşça deri altına enjekte edin ve hayvanı tamamen iyileşene kadar izleme ile kafesine geri koyun. Aşılamadan dört ila beş gün sonra, tümörleri ölçmek için tümör bölgesini palpagt edin ve tümör hacmini belirlemek için tümörlerin hem en büyük hem de en küçük çaplarını kullanmak için bir kumpas kullanın.

Enjekte edilen 41GFP hücrelerini görüntülemek için, anestezi uygulanmış fareyi görüntüleyicinin içindeki hareketli bir sahneye yerleştirin ve tümör bölgesini floresan mikroskobu ile görüntüleyin. Laminer hava akımı biyogüvenlik kabininde, tümör hücresi enjeksiyonundan altı gün sonra, partikülleri eşit olarak dağıtmak için lipozomları girdap haline getirin ve süspansiyonun 60 mikrolitresini steril bir pipet ucuna aspire edin. Ucu, anestezi uygulanmış tümör ile aşılanmış hayvanın burun deliğine yakın bir yere yerleştirin ve farenin damlayı solumasına izin vererek, lipozom çözeltisinin beş mikrolitresini yavaşça serbest bırakın.

Hayvanın doğum sırasında düzenli nefes almasını sağlamak için uygun anestezi seviyesini korurken lipozom solüsyonunun yavaşça uygulanması çok önemlidir. 60 mikrolitrenin tamamı uygulandığında, farenin tamamen iyileşmesine izin verin ve hayvanı kafesine geri koyun. Akciğer yüzeyi metastazlarını saymak ve puanlamak için, akciğerleri diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve akciğer yüzeyinin net bir görüntüsü elde edilene kadar objektifi odaklayın.

Daha sonra her iki akciğerin ön ve arka tarafındaki mezotizleri manuel olarak sayın ve tümörleri floresan mikroskobu ile görüntüleyin. Metastazları saydıktan ve görüntüledikten sonra, akciğeri kıymak için cerrahi makas ve forseps kullanın ve doku parçalarını üç mililitre sindirim tamponu içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Parçaları 37 santigrat derece inkübatörde 40 dakika boyunca dönen bir çalkalayıcı üzerinde boya testi yapın ve ardından dokuyu ayırmak için bulamacı triterate edin.

Daha sonra, herhangi bir topaklanmayı çıkarmak için doku süspansiyonunu 40 mikronluk bir süzgeçten süzün, daha büyük parçaları gerektiği gibi bir şırınga pistonu ile süzgeçten bastırın. Tek hücreli bir süspansiyon elde edildiğinde, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve kırmızı kan hücrelerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ACK tamponu ile parçalayın. Ardından, peleti sekiz mililitre RPM'de iki kez yıkayın.

İkinci santrifüjlemeden sonra, hücreleri saymak için üç mililitre tam RPMI ortamında askıya alıyoruz ve hücreleri tekrar döndürüyoruz. Şimdi hücreleri, 100 mikrolitre FAX tampon konsantrasyonu başına bir kez 10 ila altıncı hücreye seyreltin ve 100 mikrolitrelik hücre eloquotes'unu V tabanlı, 96 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Santrifüjleme ile kuyuların dibindeki hücreleri toplayın, ardından tamponun dışarı akmasını sağlamak için plakayı ters çevirin.

Hücreleri 100 mikrolitre CD16 CD32 FC bloğu ile dört santigrat derecede 15 dakika boyunca bloke edin ve plakayı tekrar santrifüjleyin. Ardından, az önce gösterildiği gibi süpernatanı çıkarmak için plakayı çevirin ve ilgilenilen antikor kokteylini uygun kuyucuklara ekleyin. Dört santigrat derecede 30 dakika sonra, hücreleri santrifüjleme ile peletleyin, ardından 200 mikrolitre FAX tamponu ile yıkayın.

Daha sonra peletleri 200 mikrolitre taze PBS'de yeniden süspanse edin ve numuneleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca canlı boya ile boyayın. İnkübasyonun sonunda, hücreleri başka bir 200 mikrolitre PBS'de yıkayın ve numuneleri dört santigrat derecede saklamak için 100 mikrolitre yüzde bir paraformaldehit içinde sabitleyin. Analizlerinden hemen önce, hücre süspansiyonlarını polipropilen akış sitometri tüplerine aktarın.

4T1GFP tümör hücrelerinin meme yağ yastığına enjeksiyonu, akciğerlerde gözlenen hızla oluşan metastazların kanıtladığı gibi, insan meme kanserinin metastatik yayılımını özetleyen fare tümörlerinin oluşumuna yol açar. 4T1 hücrelerinin GFP ile stabil transfeksiyonu, metastaz yapan tümör hücrelerinin izlenmesini ve metastatik yükün ölçülmesini kolaylaştırır. Rutin hastoloji, dijital patoloji algoritmaları ile birlikte metastazları ölçmek ve doğrulamak için iyi bir araç sağlar.

Ayrıca, çok renkli akış sikometrik analizi, CD11b negatif, CD11c F80 pozitif alveolar makrofajlar gibi nadir hücre popülasyonlarının bile karakterizasyonuna izin verir. Biclotrenate'in tükenmesi, lipozom ile tedavi edilen hayvanların ayrışmış akciğerlerinde bu CD11c F480 pozitif hücrelerin yokluğu ile doğrulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, tümör hücrelerinin meme yağ yastığına nasıl enjekte edileceğini, tümör büyümesini ve metastazı nasıl izleyeceğinizi, alveolar makrofajları nasıl tüketeceğinizi ve akciğer hücrelerini akış sikometrik analizi için nasıl hazırlayacağınızı iyi anlamalısınız.