Çok elektrot dizilerde Spiral Ganglion Nöron Eksplantasyon Kültür ve Elektrofizyoloji

Bu prosedürün genel amacı, işitsel nöronların elektrofizyolojik aktivitesinin çok elektrotlu diziler üzerinde nasıl kültürleneceğini ve kaydedileceğini göstermektir. Bu yöntem, işitsel nöronların elektrofizyolojik özelliklerinin karakterize edilmesi ve elektrot alanları tarafından uyarılması gibi işitme araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok sayıda işitsel nöronun nöronal aktivitesinin hücre dışı non-invaziv eşzamanlı olarak kaydedilmesine izin vermesidir.

Bu tekniğin etkileri terapiye kadar uzanır. Aslında, sağır hastalarda işitmeyi geri kazandırmak için koklear implant gibi protezlerinizin elektronöron arayüzünü uygulamak için kullanılabilirler. Bu prosedüre başlamak için, önce ECM karışımını buz üzerinde çözerek ECM kaplama çözeltisini hazırlayın.

Daha sonra ECM karışımını bazik kültür ortamında bir ila 10 oranında seyreltin ve buz üzerinde saklayın. Laminer akış başlığındaki yeni MEA'lar için, bunları 30 saniye boyunca %70 etanole batırın. Daha sonra, 30 saniye boyunca damıtılmış suyla yıkayın.

Ardından MEA'ları 30 dakika kurumaya bırakın. MEA'ları kaplamak için, soğuk 200 mikrolitrelik pipet ucu ile MEA'ların üzerine 50 mikrolitre kaplama solüsyonu pipetleyin. Ardından MEA'ların oda sıcaklığında 30 dakika ila bir saat arasında gitmesine izin verin.

Bundan sonra, kaplama çözeltisini çıkarın. % 10 FBS ve mililitre BDNF başına beş nanogram ile desteklenmiş 100 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve dokuyu kaplayana kadar oda sıcaklığında bırakın. Daha sonra, kaplanmış MEA'ları içeren Petri kabını büyük bir Petri kabına yerleştirin ve nemlendirme için PBS içeren küçük bir Petri kabı ekleyin.

Bu prosedürde, yavrunun kafasını %70 etanol ile sterilize edin. Daha sonra cilt ile kafatası arasındaki bağlantıyı sagital çizgi boyunca kesin. Sonra, kafatasını sagital olarak kesin ve beyni çıkarın.

Bundan sonra, temporal kemikleri kafatasından kesin ve steril buz gibi HBSS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, bir çift ince forseps kullanarak timpanik bülleri inceleyin ve iç kulağı izole edin. Ardından, koklea kemiğini çıkarın.

Daha sonra, spiral ganglionun bazal kısmını ve SV'yi forseps ile tutarak ve SV'yi tabandan tepeye doğru yavaşça çözerek spiral ligament ve SV'yi birlikte çıkarın. Spiral ganglionun bazal kısmını ve Corti organını forseps ile tutarak ve Corti organını tabandan tepeye doğru yavaşça çözerek Corti organını modiolustaki spiral gangliondan ayırın. Daha sonra, forseps veya ince mikro diseksiyon makası veya bıçağı kullanarak spiral gangliondan lateral eksplantları kesin.

Şimdi spiral ganglion eksplantlarını ve Corti organını MEA'ya aktarın. Ardından, SG eksplantlarını elektrot alanı ve Corti organı üzerine elektrot alanından yaklaşık beş milimetre uzağa yerleştirin. Dokuya zarar vermekten kaçınarak eksplantları ve Corti organını MEA'ların üzerine yerleştirin.

Daha sonra, MEA'ları dikkatlice inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de kültürleyin. Ertesi gün, eksplantları MEA'lara bağlanmaları açısından görsel olarak inceleyin. Ardından, art arda beş gün boyunca günlük% 10 FBS ve BDNF içeren 100 mikrolitre kültür ortamı ekleyin.

Altıncı günde,% 10 FBS ve mililitre BDNF başına beş nanogram içeren iki mililitre kültür ortamı ekleyin ve dokuyu 13 gün daha kültürleyin. Toplu 18 günlük bir kültürden sonra, MEA kültürünü oda sıcaklığında daha önce hazırlanan hücre dışı çözelti ile yıkayın. Ardından, MEA çipinin temas noktalarını bir parça doku ile kurulayın ve MEA'ları MEA tutucusuna monte edin.

Son olarak, MEA'yı kayıt kurulumuna yükleyin. Daha sonra, 300 mikrolitre hücre dışı çözelti ekleyin ve kayıttan önce sistemin stabilize olması için 10 dakika bekleyin. Şimdi, tüm elektrotlardan iki dakika boyunca spontan aktiviteyi kaydedin ve aktif elektrotları tanımlayın.

Ardından, stimülasyona yanıt veren elektrotları tanımlayın. Stimülasyon artefaktını dışlamak için, aynı elektrottan 10 kez uyarın. Kültür 10 defadan en az sekizinde yanıt verirse, elektrot kaynaklı stimülasyon üzerine pozitif bir yanıt olarak kabul edilebilir.

Bir arka plan gürültüsünü tanımlamak için, voltaj kapılı sodyum kanallarını bloke etmek için kültüre bir mikromolar konsantrasyonda TTX uygulayın ve ardından iki dakika boyunca kaydedin. İşte spontan aktivite gösteren 63 elektrottan altısının orijinal kayıtlarının izleri ve bu, sivri uç tespitinden sonra altı elektrotun raster grafiğidir. Her çubuk bir aksiyon potansiyelini temsil eder.

Bu raster çizim, tüm aktif elektrotları içerir. Aktiviteler iki dakika boyunca 63 elektrottan kaydedilir. Bu şekil, bir elektrottan kültür stimülasyonu için toplam süresi 80 mikrosaniye ve genliği 80 mikro amper olan iki fazlı bir uyaranın kullanıldığını göstermektedir.

Ham veri izlerinin bu temsili örneği, stimülasyondan sonra yanıt vermeden aksiyon potansiyellerini gösterir. Ve bu da MEA'lar üzerindeki spiral ganglion kültürü, deneyin sonunda nöronal belirteç olan TUJ için immüno-boyanmış, elektrot alanının nöronal kapsamını görselleştirmek için. Stimülasyon için kullanılan elektrot yeşil renkle gösterilir ve yanıt veren elektrotlar kırmızı ile gösterilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 50 dakika içinde yapılabilir. Bu yöntemler spiral ganglion nöron elektrofizyolojisi hakkında bilgi sağlayabilse de, beyin veya omurilik kültürleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Geliştirmeden sonra, bu teknik, malzeme bilimi ve nanoteknoloji alanındaki araştırmacıların, nöronal kayıt ve stimülasyon elektrotlarının hızlı leke yüzey modifikasyonunun önünü açıyor.

Bu videoyu izledikten sonra, çok elektrotlu diziler üzerinde bir nöron eksplantı düzenleyerek elektrofizyolojik aktivitenin nasıl kültürleneceğini ve kaydedileceğini iyi anlamış olmalısınız.