Name: Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Öğrenin, DC 2.4 hücreleri ve konfokal mikroskopi kullanarak fagositozun erken aşamalarını görselleştirmeyi. Bu yöntem, patojenlerin konak hücrelere giriş mekanizmalarını anlamak için zaman duyarlı analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz görüntüleme için MİT Whitehead Enstitüsü Wendy Somon ve Keck tesisin Nicki Watson teşekkür ederim.

DC2.4 ve RAW 264.7 Hücre Hatları 1. Hazırlık Not: makrofaj benzeri hücre hattı RAW 264.7 ve dendritik hücre çizgisi DC2.4 hem sıçangil kökenli ve aşağıdaki koşullar hücreleri büyütmek için kullanıldı. <ol><li> Ile takviye edilmiş DMEM içinde RAW 264.7 hücreleri (Dulbecco minimal Eagle ortamı) büyütün% 10,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de etkisiz hale getirilmiş fetal sığır serumu (FBS). </li><li> L-Glutamin yerine DMEM ile takviye edilmiş RPMI kullanımı (Roswell Park Memorial Institute) ortamı dışında RAW 264.7 hücreleri bu benzer koşullar altında DC2.4 hücreleri büyütün. </li></ol> 2. Fluoresan Konjuge parçacıkların hazırlanması: C. albicans, zimosan, IgG kaplı boncuklar <ol><li> Candida albicans Büyüyen <ol><li> URI (% 2 Bacto-pepton,% 1 ile takviye YPD 25 ml donmuş gliserol stokundan bir C. albicans soyu SC5314 inokülemaya ekstresi,% 2 glukoz ve gece boyunca 30 ° C&#39;de 80 ug / ml Üridin). NOT: OD 12 600 den fazla Candida kültürü büyüyen kaçının. </li><li> C. albicans 1 ml alın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.000 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> Süpernatantı aspire ve 1 ml PBS ile pelet yeniden askıya. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüj ile pelet toplayın. </li><li> Adımı tekrarlayın 2.1.4. </li><li> Fagositler sayısına göre C. albicans enfeksiyonu (İB) arasında çok sayıda hesapla ve bölüm 3 OD tarif edildiği gibi 1, 600 1, ml başına 2.5 x 10 7 Candida albicans eşdeğerdir fagositoz testinde devam edin. Not: Candida-BFP Üretimi referans 13&#39;de açıklanmaktadır. </li></ol></li><li> Zimosan ve IgG kaplanmış tanelerin hazırlanması Not: zimosan bir β-glukan içerenSaccharomyces cerevisiae türetilen mantar karbohidrat parçacık hazırlanması. Zimosan makrofajlar ve dendritik hücreler ve inflamasyonun uyandırmak için bilinmektedir ve bu fagositoz çalışmaları 13, 14, 15, yaygın olarak kullanılmaktadır. <ol><li> Kısaca partikülleri içeren tüp vorteks ve 1.5 ml tüp içine bir deney için yeterli bir miktar kısım. NOT: Genelde biz (bir hücre için, 10 zimosan parçacıkları veya IgG kaplı boncuklar ekleyin) 01:10 oranını kullanın. </li><li> gibi soğuk PBS ile 1 ml ilave edilir ve 10,000 x g &#39;de 1 dakika süre ile santrifüjleme ile parçacıkların toplanması. </li><li> Süpernatant aspire ve 1 ml buz gibi soğuk PBS pelletini. </li><li> Adımları tekrarlayın 2.2.2-2.2.3 Not: 2.2.5 adım veya kullanılana kadar 4 ° C &#39;de tüp depolamak için devam edin. </li><li> Bir önlemek için ultrasonik banyo sonikatörü içinde 10 sn için parçacık (120 V, 50-60 kHz) sonikasyonny parçacık toplama. </li></ol></li></ol> 3. Fagositoz Not: Fagositoz partikülünün yüzeyinde ligandlarla PRRS etkileşimiyle fagositlerin hücre yüzeyi üzerinde parçacıkların bağlanması ile başlayan karmaşık bir süreçtir. Bağlama aktin montaj ve temas yerinde ilişkili proteinler ve fagositik fincan oluşumu tarafından takip edilir. daha sonra aktin sökme fagozomun oluşur ve partikül tam yutulma sonuçlanır. biz fagositoz farklı aşamalarını tarif görebilirsiniz. <ol><li> Bağlanma Deneyi NOT: Bu deneyin amacı, hedef partikülleri üzerine ligand ve fagositlerle ilgili reseptörleri arasındaki etkileşimi, fagositoz ilk adım izlemektir. <ol><li> Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Alternonları bir arada, kapak slipleri üzerine plakası hücreleri ya da cam-tabanlı 96 oyuklu plakalar (24 ya da 12 oyuklu bir formatta). Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin. Not: Hücreler, hemasitometre veya benzer bir teknik kullanılarak sayılabilir. </li><li> 10 dakika boyunca 10 ° C&#39;de odasına slayt (veya plakası) yerleştirin. </li><li> Yavaşça her bir kuyunun bir pipet veya aspiratörü kullanarak orta çıkarın. DİKKAT: odacıklı coverglass sisteminin her kuyu küçük dikkatle bu adımı gerçekleştirin; bir pipet ucu veya aspiratör güçlü bir hava akımı ile hücreleri karıştırmayı kolaydır. </li><li> bir hücre kültür ortamı ile floresan etiketli parçacıkları karıştırın (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmıştır). Hücrelere, (10 MOl&#39;de) floresan konjüge-zimosan veya lateks boncuklar-tavşan IgG-FITC (hücre başına 10 parçacıklar) Candida -BFP ekleyin. Tüm hücreler sahiptir sağlamak için de bir odadan 200 ul ortam bir son hacim kullanın. </li><li> 277 de kamara slayt aşağı Spin10 ° C&#39;de 3 dakika boyunca xg. Not: Bu santrifüj adımı parçacık ve hücreler arasındaki teması artırmak için yardımcı olur ve bağlayıcı işlem eşitler. </li><li> Hemen 5 dakika için% 5 CO2 içeren bir 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör odasına slayt aktarın. </li><li> inkübatör odasına slayt çıkarın ve medya aspire. </li><li> Hücreler buzla soğutulmuş PBS ile 3 kez yıkayın. NOT: ışık mikroskobu ile bağlanmamış parçacıkların varlığını kontrol edin ve gerekirse PBS ile birkaç kez yıkayın. Analiz sırasında arka plan gürültüsünü en aza indirmek için kuyudan bağlanmamış parçacıkları çıkarmak için esastır. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edilerek, PBS içinde seyreltilmiş 500 ul% 4 paraformaldehit (PFA) eklenerek hücrelerin sabitleyin. DİKKAT: Bu adım, yüksek toksik, paslandırıcı ve potansiyel kanserojendir% 4 PFA kullanılmasını gerektirir. Bu sıvıyı kullanırken uygun dikkatli alınmalıdır. Ayrıca, ışık örnekleri korur. </li><li&gt; Odasına PBS 500 ul ekleyerek hücrelerin yıkayın ve yavaşça çözüm aspire. </li><li> iki kere 3.1.9 adımı yineleyin. NOT: Bu aşamada, hemen önceki PBS çıkardıktan sonra her flakon doldurun. </li><li> 10 dakika boyunca PBS içinde 50 mM NH4CI 500 ul inkübe edilerek tespit durdurun. </li><li> Aşama 3.1.10 tarif edildiği gibi PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (PBS içinde% 0.1 saponin,% 0.2 BSA) bağlayıcı tampon 250 ul ilave edilerek hücreler geçirgenliği. </li><li> Leke (: bağlayıcı tampon içinde 500 1 seyreltilmiş) floresan konjuge Phalloidin ekleyerek F-aktin. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile inkübe hücreleri. </li><li> Aşama 3.1.10 de tarif edildiği gibi hücreler PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> Konfokal mikroskop (63X objektif ve 402 nm ve 488 nm lazer) kullanarak görüntüleri yakalayabilir ve ImageJ 16 kullanarak görüntüleri analiz. Not: başarılı bir parçacık fagositik cu varlığı ile karakterize edilir bağlanmayerinde p nerede partikül temas fagositik hücre (Şekil 1). adım 3.2.5 bakınız. </li></ol></li><li> Fagositoz Uptake Tahlili Not: Bu deney konfokal mikroskobu (Şekil 2) kullanılarak fagositlerce floresan etiketli parçacıkların tam içselleştirilmesini izlemek için tasarlanmıştır. <ol><li> Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Seçenek olarak ise, kapak slipleri üzerine plakası hücreleri ya da cam-tabanlı 96 oyuklu plakalar (24 ya da 12 oyuklu bir formatta). Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin. Not: Hücreler, hemasitometre veya benzer bir teknik kullanılarak sayılabilir. </li><li> 10 dakika boyunca 10 ° C&#39;de odasının slaytlar (veya plakası) tutun. NOT: Soğutma senkronize bir fagositoz için sonradan endositoz yanı sıra istenmeyen fagositoz engellemek ve için gereklidir. </li><li> perf3.1.3 den 3.1.5 için orm adımlar </li><li> % 5 CO2 içeren bir 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör odasına slayt aktarın ve farklı zaman noktalarında inkübe edilir. 30, 60 ve 90 dakika sonrası enfeksiyondan sonra hücrelerin sabitleyin. C. albicans 60 dakika sonrası enfeksiyon hif oluşmaya başlar gözlemlemek; fagositler 90 dakika 8 sonra hücre ölümünü (pyroptosis) göstermeye başlar. Not: Bu bir öneridir ve optimizasyon hücre tipine ve kullanılan parçacık bağlı esastır. </li><li> 3.1.7&#39;de den 3.1.15 adımları uygulayın. ImageJ 16 kullanarak görüntüleri analiz edin. Not: başarılı bir alım bir fagosit sitoplazması içinde bir parçacık tam içselleştirme ile karakterize edilir (Şekil 2). Böyle Phalloidin olarak hücre yüzey işaretleyici ile fagositler boyanan hücrelerin kontur çizmek için yardımcı olur. Parçacık, hücre yüzeyi ya YAPIM bağlı olup olmadığını belirlemek için, aynı zamanda sırayla Z yığınları yerine esastıretely içselleştirilmiş. </li></ol></li><li> Fagositoz Canlı Görüntüleme NOT: Bu protokolde floresan konjuge zymosan kullanarak fagositoz farklı aşamalarında yakalamak için konfokal mikroskopi kullanımını tanımlamak. Biz istikrarlı bir şekilde mCherry etiketli F-aktin 8 ifade dendritik hücre hattını DC2.4, canlı hücrelerde ipliksi aktin dağılımını gösteren bir biyosensör kullanın. Fagositoz bir aktin odaklı süreç olduğu için bu hücrede canlı görüntüleme F-aktin ağ hareketini ve dinamiklerini yakalamak için bize sağlar, fakat aynı zamanda canlı hücrelerin içinde farklı fagositik olayları (Şekil 3, Film 1) görselleştirmek için değil sadece. <ol><li> Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir konsantrasyonda bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin. NOT: Hücreler hemasitometre veya kullanılarak sayılabilirBenzer bir teknik. </li><li> 10 dakika buz üzerinde odasının slaytlar tutun. Not: Soğutma istenmeyen alımını engellemek için, bir senkronize fagositoz olması için gereklidir. </li><li> 3.1.3 den 3.1.5 için adımları uygulayın </li><li> 37 ° C mikroskop aşamasında önceden ısıtmak ve% 5 CO2 ile bölme dengeye. Görüntüleme başlamadan önce stabilize etmek için sıcaklık ve CO 2 için 30-45 dakika bekleyin. NOT: CO 2 ve sıcaklık seviyeleri fagositoz için kritik olduğundan, çevre odasına dengelenmesi deney öncesinde mikroskop ısıtıcı açmak için çok önemlidir. </li><li> 37 ° C ve% 5 CO2 seviyesinde dengelenmiş mikroskop inkübatör muhafaza içinde hücreleri ihtiva eden odası slayt yerleştirin. </li><li> Canlı görüntüleme 17, 18 gerçekleştirin. NOT: Lazer gücü (kazanç, iğne deliği, vs.) ayarları th türüne bağlı olarak değişebilire mikroskop ve floresan prob kullanılır. Bu nedenle, biz canlı görüntüleme 17,18 optimal durum için mikroskop kılavuzuna danışmanızı öneririz. <ol><li> odaklı lazer tarama mikroskobu (ve ilgili yazılım) canlı görüntüleme için kullanılır. 1-1,1 Havalı birimlerinin bir toplu iğne deliğine sahip 63X 1.4NA yağı amacı kullanın. </li><li> görüntüleme başlatmak için, oda slaytta bir temsilci bölgesini bulmak için parlak bir alan kullanılır. Sonra, yazılım üzerinde pozisyonu seçeneğini tıklatarak alanı seçin. 488 ve 582 nm arasında dalga boylarını algılayacak şekilde, 582 nm dalga boyunda bir ışın ayırıcı ile 488 nm lazer için filtre seti kullanılan Takip 1 GFP tespit etmek. </li><li> Takip 2 mCherry (RFP) için en uygun ayarlanmış bir filtre 578 nm ışın ayırıcı kullanarak ve nm 578 ila 600 dalga boylarını tespit seçin. 488 nm ve% 50 lazer güç ve 600-700 bir kazanç çıkışı ile 578 nm lazer kullanır. 90 dakika olmak üzere toplam görüntüleri her 30 sn edinin. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Information processing during phagocytosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+macrophage+%26%2334%3Bprobing%26%2334%3B+is+required+for+the+efficient+capture+of+phagocytic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic macrophage &#34;probing&#34; is required for the efficient capture of phagocytic targets.</a> J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).</li>
<li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li>
<li>Botelho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+biphasic+changes+in+phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+at+sites+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis.</a> J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).</li>
<li>Tafesse, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Sphingolipid+Biosynthesis+Blocks+Phagocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 11, e1005188(2015).</li>
<li>Kwik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+cholesterol%2C+lateral+mobility%2C+and+the+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate-dependent+organization+of+cell+actin%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin.</a> PNAS. 100, 13964-13969 (2003).</li>
<li>Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+in+phagocytosis+and+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22BBA%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis.</a> BBA. 1851, 805-823 (2015).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Strijbis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton%27s+Tyrosine+Kinase+%28BTK%29+and+Vav1+contribute+to+Dectin1-dependent+phagocytosis+of+Candida+albicans+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages.</a> PLoS Pathog. 9, e1003446(2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-glucan+receptor+Dectin-1+activates+the+integrin+Mac-1+in+neutrophils+via+Vav+protein+signaling+to+promote+Candida+albicans+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance.</a> Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).</li>
<li>Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+recognition+is+mediated+by+the+association+of+dectin-1+and+galectin-3+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages.</a> PNAS. 108, 14270-14275 (2011).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24974023">Fluorescence live cell imaging.</a> Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+that+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
<li>Jaumouille, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+reorganization+by+Syk+regulates+Fcgamma+receptor+responsiveness+by+increasing+its+lateral+mobility+and+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering.</a> Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).</li>
<li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Immunopath%22%5BJournal%5D)">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).</li>
<li>Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+host-Leishmania+interactions%3A+significance+in+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Para.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis.</a> Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).</li>
<li>John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii.</a> Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

makrofajlar ve dendritik hücreler gibi profesyonel fagositler, yutmak ve bu nedenle işgalci patojenlere konak savunma sisteminin önemli bir bileşeni fagositozunu yapma ortadan kaldırır. Bu işlem sırasında fagositler, hücre yüzeyi 8, 19, 20, geniş bir membran yeniden düzenlenmesi ve hücre iskeleti bir yeniden düzenlenmeye maruz. daha bu dinamik süreci anlamak için, fagositoz farklı aşamalarında görselleştirme esastır. Burada fag...

Bakteriler, virüsler ve mantarlar gibi patojenlere sürekli maruz kalma rağmen, vücudumuzun iyi enfeksiyona karşı koruma sağlayan bağışıklık mekanizması ile donatılmıştır. doğuştan gelen bağışıklık sistemi işgalci patojenlere karşı ilk savunma hattıdır ve tanımak ve yabancı hedeflere içselleştirmek fagositik hücreler esas dayanır. Fagositoz 0.5 um&#39;den daha büyük, istenmeyen parçacıkların yutulmasına kapsar evrimsel olarak muhafaza edilmiş hücresel bir süreçtir. Fagositik hücreler yutulma 3 önce patojenler üzerinde mevcut olan patojenle ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) tanımasını sağlamak hücre yüzeyinde (aynı zamanda görüntü tanıma reseptörleri PRR&#39;ler olarak da bilinir), bağışıklık reseptörlerin geniş bir ifade eder. Patojen hücre yüzeyindeki reseptör kümeleme tarafından takip ve bir fagositik fincan oluşumunu tetikler bağlama. Bu çevrede çıkıntı aktin odaklı membran yeniden sonuçlanırHedef, sonunda onu saran ve kıstırma-off ayrı bir phagosomal çarpıtma 2, 5 oluşturulur. Fagosom sonra olgunlaşır phagolysosome 6 oluşturan Geç endozomlar ve lizozomlar ile daha sonra füzyon yoluyla acidifies. Fagositoz reseptör aracılı aktin odaklı bir olay olarak tarif edilmiş olmasına rağmen, bu işlem aynı zamanda, fosfoinositidlerde (İng) ve sfingolipidler 7, 8, plazma zarını oluşturan lipidler, mekansal ve zamansal değişikliği dayanır. Aktin polimerizasyonu fagositik fincan dibinde fosfoiyonositol-4,5-bifosfat (PI (4,5) P2) yerel bir birikimi tarafından dikte edilirken, aktin depolimerizasyon (PI (4,5) P dönüşümü bağlıdır 2 fosfoinositol-3,4,5-bifosfat için (PI (3,4,5) P3) 3, 9. Her iki modifikasyonundahedef etrafında psödopod ve ikinci phagocyte 10 sitozolde parçacıkların batan sağlayan başarılı uzantısı eski yol açar olarak önemlidir. Fagosite yeteneğine sahip hücreler, ya -profesyonel fagositlerin, makrofajlar / monositler, granülositler / nötrofil ve dendritik hücreler (DC) ya da fibroblast ve epitel hücreleri 11 ile profesyonel olmayan fagositler gibi. profesyonel fagositler tarafından gerçekleştirilen fagositoz patojenlere karşı doğal ve kazanılmış bağışıklık yanıtının koordinasyonundan sorumlu iken, tüm fagositler tarafından gerçekleştirilen fagositoz, doku bakım ve yeniden merkezi bir rol oynar. Profesyonel fagositler sadece adaptif bağışıklık sisteminin lenfoid hücrelere de mevcut antijenleri yutan ve patojen öldürmek, yok ama. Bundan dolayı, bu yol, pro-enflamatuar sitokinlerin salınması ve lemfoid hücrelerin katılımı katkıdaenfeksiyon 12 başarılı blokajı. Geleneksel biyokimyasal teknikler post-translasyonel modifikasyonlar ve proteinler arasındaki çeşitli yüksek afiniteli birlikleri gibi fagositoz sırasında farklı hücresel süreçleri, moleküler mekanizması ile ilgili bilgi kazanıyor vesile olmuştur. Bununla birlikte, bilinen biyokimyasal yöntemler kullanılarak fagositik etkinlik mekansal ve zamansal dinamikleri ile ilgili bilgiler elde etmek zordur. Canlı hücre görüntüleme sadece bize zaman hassas bir şekilde hücresel olayları izlemek için izin verir ama aynı zamanda bir tek hücre düzeyinde bilgi edinmek için bize sağlar. Burada fagositoz farklı aşamalarında araştırmak için bir yöntem tarif yanı sıra konfokal mikroskopi kullanılarak spatiotemporally tüm süreci analiz etmek.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi&nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-fenilindol, Dilaktat)</td> <td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Minimal Kartal' s orta)</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (Fosfat-Tamponlu Salin)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır serumu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>FITC'ye bağlı IgG kaplı lateks boncuklar</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit Çözeltisi (PBS'de %4))</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 hücre</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Enstitüsü)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi (PBS'de %0,4 (a/h))</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (1x) (%0,05)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Yüzey Aktif-Amps Deterjan Çözeltisi</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; 85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>Odacıklı 1.0 Borosilikat Kapakcam sistemi (8 odacıklı)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Izgaralı cam slayt 10</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

fagositoz erken aşamaları görselleştirme

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

memeli vücut patojen istilası kendisini savunmak için yardımcı mekanizmaların çeşitli katmanları ile donatılmıştır. Nötrofiller, dendritik hücreler ve makrofajlar gibi - - bağışıklık sisteminin -profesyonel fagositlerin algılar ve fagositoz 1 boyunca bu işgalci patojenlere temizlemek için doğal yeteneğini muhafaza. Fagositoz hücre yüzeyinde 2, 3 membran yeniden ve aktin biçimlenme koreografi olayları kapsar. Fagositler başarıyla içselleştirmesi ve fagositoz tüm aşamaları yerine sadece yabancı molekülleri ortadan kaldırmak. Bu adımlar tanıma ve hücre yüzeyinde bulunan örüntü tanıma reseptörleri tarafından patojen (PRR) bağlanmasını içerir, aktin-zenginleştirilmiş membranöz çıkıntıları (psödopod) aracılığıyla fagositik fincan oluşumu partikül çevreleyen ve fagozomun kesme phagolysosome olgunlaşması ile izledi sonuçlanırpatojen 3, 4 öldürülmesi. fagositoz çeşitli aşamalarında Görüntüleme ve miktar bu hücresel sürecin moleküler mekanizmaların için enstrümantal. Mevcut el yazması fagositoz farklı aşamalarını incelemek için yöntemler bildirir. Biz görselleştirmek ve bağlayıcı, fagositik fincan oluşumunu ölçmek için bir mikroskop temelli bir yaklaşım ve fagositlerce partikül içselleştirilmesi açıklar. Fagositik hücreler üzerinde doğuştan reseptörleri den büyük 0,5 mikron, burada mevcut tahliller patojenik mantar Candida albicans ve zimosan ve IgG kaplı boncuklar gibi diğer parçacıkların kullanımını içermektedir hedef parçacığa ligandlar karşılaştıklarında fagositoz oluşur olarak.

fagositoz farklı aşamalarında izlemek için mikroskop tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. DC2.4 hücreleri tarafından çeşitli floresan parçacıkların fagositozu sırasında farklı olaylar gösterilir. Burada tarif edilen teknikler kullanılarak, fagositoz erken aşamalarında sfingolipidler rolünü araştırdık. Bu amaçla, Sptlc2, sphingolipid biyosentetik yolundaki birinci ve oran kısıtlayıcı aşamayı katalizleyen enzim genetik eksikliği DC2.4 dendritik hücreler kullanıldı. Vahşi tip hücrelere kıyasla, Sptlc2 olarak - / - ...

Burada, Candida albicans mantarları ve zimozan ve IgG kaplı boncuklar dahil olmak üzere 0,5 μm'den büyük partiküller gibi patojenlerin fagositozu sırasındaki olayların erken kaskadlarını görselleştirmek ve ölçmek için mikroskop tabanlı bir tekniği açıklıyoruz.

Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Bu tekniğin amacı, konfokal bir mikroskop kullanarak fagositozun farklı aşamalarını izlemektir. Bu yöntem, çapraz patojen etkileşimleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Esas olarak enfeksiyon sırasında patojenlerin konakçı hücrelere nasıl girdiğini anlamak için.Bu tekniğin en büyük avantajı, basit olması ve fagositoz sırasında meydana gelen olaylarımızın virüs hücresi hakkında zamana duyarlı bir şekilde bilgi edinmemizi sağlamasıdır. Başlamak için, floresan konjuge zymosanı ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Önceki gün, bir oda slaytında yaklaşık beş kez 10 ila dördüncü DC 2.4 hücresine tohum atın, böylece deney sırasında kuyucuklar %60 ila %70 oranında birleşmiş olur.Hücreler uygun bir yoğunluğa geldiğinde, hazne sürgüsünü 10 dakika boyunca 10 santigrat dereceye yerleştirin. Hücrelerin soğutulması, endositozu bloke etmek ve sitozun ne zaman değiştirileceği için gereklidir. Ve daha sonra senkronize bir fagositoza sahip olmak.Ardından, bir pipet veya aspiratör kullanarak ortamı her kuyudan yavaşça çıkarın. Daha sonra, floresan konjuge zymosanı hücre kültürü ortamı ile 10'luk bir enfeksiyon çokluğunda karıştırın. Daha sonra, tüm hücrenin kaplandığından emin olmak için her bir hazneye 500 mikrolitre ortam ekleyin.Ardından, hem hücrelerdeki partiküller arasındaki temasları artırmak hem de bağlanma işlemini senkronize etmek için hazne sürgüsünü aşağı doğru döndürün. Santrifüjlemeyi takiben, hazne sürgüsünü yüzde 5 CO2 içeren 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın. 37 santigrat derecede beş dakika sonra, hazne sürgüsünü inkübatörden çıkarın ve ortamı aspire edin.Ardından, hücreleri buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, ışık mikroskobu ile bağlanmamış parçacıkların varlığını kontrol edin ve gerekirse ek yıkamalar yapın. Analiz sırasında arka plan gürültüsünü en aza indirmek için bağlanmamış parçacıkları kuyulardan çıkarmak çok önemlidir.Daha sonra, kuyucuklara PBS'de 500 mikrolitre yüzde dört paraformaldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hücreleri sabitledikten sonra, her hazneye 500 mikrolitre PBS ekleyerek ve ardından çözeltiyi nazikçe aspire ederek yıkayın. Yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.Üçüncü yıkama turunu takiben, hücrelere PBS'de 500 mikrolitre 50 milimolar amonyum klorür ekleyerek ve 10 dakika inkübe ederek reaksiyonu durdurun. Ardından, hücreleri 500 mikrolitre oda sıcaklığında PBS'de yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa 500 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyerek ve hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ederek hücrelere nüfuz edin.Bir sonraki adım, hücrelere floresan konjuge phalloidin ekleyerek ve onları oda sıcaklığında bir saat inkübe ederek F-aktin için boyama yapmaktır. Daha sonra hücreleri 500 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Son olarak, konfokal bir mikroskop kullanarak görüntüleri yakalayın ve ImageJ kullanarak görüntüleri analiz edin.Zymosan alımını ölçmek için, bağlanma tahlilinde gösterildiği gibi hücreli oda slaytları hazırlayın. Soğutma ve etiketleme adımlarını takiben, hazne sürgüsünü yüzde beş CO2 içeren 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın. Ve hücreleri farklı zaman noktaları için inkübe edin.Enfeksiyondan 30, 60 ve 90 dakika sonra hücreleri düzeltin. Bu zaman noktalarını, ilgili hücre tipine ve kullanılan floresan parçacıklarına göre optimize ettiğinizden emin olun. Ardından, ImageJ kullanarak görüntüleri analiz edin.Başarılı alım, bir fagositin sitoplazması içindeki bir partikülün tamamen içselleştirilmesi ile karakterize edilir. Başlamak için, 37 santigrat dereceye kadar ısıtarak ve odayı yüzde 5 CO2 ile dengeleyerek bir mikroskop aşaması çevre odası hazırlayın. Görüntülemeden önce sıcaklığın ve CO2'nin stabilize olması için 30 ila 45 dakika bekleyin.CO2 ve sıcaklık seviyelerini görmek, fagositoz için kritik öneme sahiptir, o odanın ortamını dengelemek için deneyden önce mikroskop ısıtıcısını açmak da önemlidir. Daha sonra, bağlanma tahlilinde gösterildiği gibi eksprese mCherry F-aktin'i stabilize eden DC 2.4 hücreli oda slaytları hazırlayın. Soğutma ve etiketleme adımlarını takiben, hazne sürgüsünü santrifüjden doğrudan önceden ısıtılmış bir mikroskop aşamasına aktarın.Son olarak, yalnızca F-aktin ağının hareketini ve dinamiklerini yakalamak için değil, aynı zamanda canlı hücreler içindeki farklı fagositik olayları görselleştirmek için ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak canlı görüntüleme gerçekleştirin. Burada yeşil renkle gösterilen hücreler, kırmızı ile gösterilen Kanada BFP'si ile enfekte olmuş vahşi tip bir DC 2.4 hücresidir. Timelapse görüntüleme, fagositozun erken aşamalarını görselleştirmek için kullanılır ve burada 30 saniyelik aralıklarla gösterilir.Yıldız işaretiyle gösterilen konumlar, aktin yeniden şekillenmesinin meydana geldiği yerlerdir. Tüm süreç birkaç dakika içinde gerçekleşir. Burada sfingolipidlerin rolü, fagositozun erken evrelerindeki rolleri açısından değerlendirildi.Bu teknik kullanılarak, sfingolipidlerin candida albicans'ın hücrelere bağlanması ve genel fagositozun azaltılması için gerekli olduğu bulundu. Fagositotik bağlanmadaki bu azalma, DC 2.4 hücresinin zimozanlara bağlanması için de gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, fagositozun erken evresini incelemek için canlı görüntülemenin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir ila iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, bağışıklık hücreleri ile bu patojenler arasındaki karmaşık ilişkiyi anlamak için bakteriler ve parazitler de dahil olmak üzere diğer patojenlerin fagositozu gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, fagositoz ve bağışıklık hücrelerinde makropinositoz dahil olmak üzere reseptör aracılı endositozu keşfetmelerinin yolunu açtı.

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, bağımsız makrofaj aracılı kırmızı kan hücresi (RBC) fagositoz olaylarını izlemek için yapılan bir test gösterilmektedir. Fare immünoglobulin G (IgG) ile opsonize edilmiş insan RBC'leri fare makrofajları ile inkübe edilir ve konfokal mikroskop altında gözlenir. RBC'ler, fagositik bir kap oluşumu yoluyla makrofajlar tarafından yutulur ve lizozomal bozunma için hedeflenir.

IgG-opsonize Kırmızı Kan Hücrelerinin Makrofaj Fagositozunun Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Bu video, bir cam tabanlı çanağın yüzeyine tutturulmuş IgG-opsonize kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) makrofaj aracılı fagositozu sırasında fagozom oluşumunun ve kapanmasının gerçek zamanlı görselleştirilmesi için yüksek çözünürlüklü bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu tekniğini göstermektedir. Makrofajlar, RBC'lerin etrafına psödopodia uzatır ve onları fagozomların içine sokar ve onları cam yüzeyden ayırır.

Fagozom Oluşumu ve Kapanışının TIRF Mikroskobu Tabanlı Görselleştirilmesi

Biz canlı hücre Video mikroskopi yöntemleri...

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Burada, florometrik bir yöntem kullanarak yapışık makrofaj hücre hattı ile floresan parçacıkların fagositozunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, partikül içselleştirmesinin yanı sıra ortaya çıkan aktin polimerizasyonunun yüksek verimli bir miktar tayinini kolaylaştırır.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

Toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, canlı makrofajlarda eşi benzeri görülmemiş yüksek çözünürlüklü fagozom oluşumunu ve kapanışını üç boyutta görselleştirmek için bir deney düzeneği tanımlıyoruz. Fagositik kabın tabanının, uzayan psödopodların ve ayrıca fagozom kesilmesinin kesin yerinin izlenmesine izin verir.

&quot;Fagozomun Kapatma Deneyi&quot; kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize&#39;a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

Bu yazıda phagosomal pH ve alan olarak rasyometrik göstergesi seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ya da S-1 kullanılarak, insan ve fare nötrofillerin sitoplazmik pH'ını ölçmek için basit bir yöntem tarif etmektedir. Bu canlı hücre konfokal floresan mikroskop ve görüntü analizi kullanılarak elde edilir.

Nötrofil fagozomun Görüntüleme ve Sitoplazma bir oranlı metrik pH Göstergesi kullanma

Burada dönen disk confocal mikroskobu görüntüsü tek fagositik olayları için fare ikamet periton makrofajlar tarafından kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralları diğer fagositik hücreler için genişletilebilir.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Leishmania enfeksiyonunda fagositoz ile ilişkili mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania etkileşimi sırasında konakçı hücrelerle meydana gelen erken olayları değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Konfokal Mikroskopi ile Leishmania Fagositozunun İncelenmesi

Burada sunulan, pH'a duyarlı bir floresan moleküle konjuge edilen opsonize olmayan maya (zymosan) parçacıklarının makrofaj (MΦ) fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) aracılı regülasyonunun dinamik görüntülerini ölçmek ve üretmek için bir protokol sunulmaktadır.

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

Bu çalışma, memeli hücrelerinde Godanti Bhasma (GB) parçacıklarının fagositik işlenmesini, hücresel alımlarını, vakuol dinamiklerini, asitleşmelerini ve bozunmalarını karakterize ederek aydınlatmaktadır. Bu bulgular sadece temel fagositoz mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı ilerletmekle kalmaz, aynı zamanda GB'yi yeni terapötik stratejiler geliştirmek için umut verici bir model sistem olarak kurar.

Memeli Hücrelerinde Godanti Bhasma Tarafından Tetiklenen Fagositozun Sıralı Hücresel Olaylarının Araştırılması

Öğrenin, DC 2.4 hücreleri ve konfokal mikroskopi kullanarak fagositozun erken aşamalarını görselleştirmeyi. Bu yöntem, patojenlerin konak hücrelere giriş mekanizmalarını anlamak için zaman duyarlı analiz sağlar.

Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme

Daha fazla video keşfet