Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme

Bu tekniğin amacı, konfokal bir mikroskop kullanarak fagositozun farklı aşamalarını izlemektir. Bu yöntem, çapraz patojen etkileşimleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Esas olarak enfeksiyon sırasında patojenlerin konakçı hücrelere nasıl girdiğini anlamak için.

Bu tekniğin en büyük avantajı, basit olması ve fagositoz sırasında meydana gelen olaylarımızın virüs hücresi hakkında zamana duyarlı bir şekilde bilgi edinmemizi sağlamasıdır. Başlamak için, floresan konjuge zymosanı ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Önceki gün, bir oda slaytında yaklaşık beş kez 10 ila dördüncü DC 2.4 hücresine tohum atın, böylece deney sırasında kuyucuklar %60 ila %70 oranında birleşmiş olur.

Hücreler uygun bir yoğunluğa geldiğinde, hazne sürgüsünü 10 dakika boyunca 10 santigrat dereceye yerleştirin. Hücrelerin soğutulması, endositozu bloke etmek ve sitozun ne zaman değiştirileceği için gereklidir. Ve daha sonra senkronize bir fagositoza sahip olmak.

Ardından, bir pipet veya aspiratör kullanarak ortamı her kuyudan yavaşça çıkarın. Daha sonra, floresan konjuge zymosanı hücre kültürü ortamı ile 10'luk bir enfeksiyon çokluğunda karıştırın. Daha sonra, tüm hücrenin kaplandığından emin olmak için her bir hazneye 500 mikrolitre ortam ekleyin.

Ardından, hem hücrelerdeki partiküller arasındaki temasları artırmak hem de bağlanma işlemini senkronize etmek için hazne sürgüsünü aşağı doğru döndürün. Santrifüjlemeyi takiben, hazne sürgüsünü yüzde 5 CO2 içeren 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın. 37 santigrat derecede beş dakika sonra, hazne sürgüsünü inkübatörden çıkarın ve ortamı aspire edin.

Ardından, hücreleri buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, ışık mikroskobu ile bağlanmamış parçacıkların varlığını kontrol edin ve gerekirse ek yıkamalar yapın. Analiz sırasında arka plan gürültüsünü en aza indirmek için bağlanmamış parçacıkları kuyulardan çıkarmak çok önemlidir.

Daha sonra, kuyucuklara PBS'de 500 mikrolitre yüzde dört paraformaldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hücreleri sabitledikten sonra, her hazneye 500 mikrolitre PBS ekleyerek ve ardından çözeltiyi nazikçe aspire ederek yıkayın. Yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.

Üçüncü yıkama turunu takiben, hücrelere PBS'de 500 mikrolitre 50 milimolar amonyum klorür ekleyerek ve 10 dakika inkübe ederek reaksiyonu durdurun. Ardından, hücreleri 500 mikrolitre oda sıcaklığında PBS'de yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa 500 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyerek ve hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ederek hücrelere nüfuz edin.

Bir sonraki adım, hücrelere floresan konjuge phalloidin ekleyerek ve onları oda sıcaklığında bir saat inkübe ederek F-aktin için boyama yapmaktır. Daha sonra hücreleri 500 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Son olarak, konfokal bir mikroskop kullanarak görüntüleri yakalayın ve ImageJ kullanarak görüntüleri analiz edin.

Zymosan alımını ölçmek için, bağlanma tahlilinde gösterildiği gibi hücreli oda slaytları hazırlayın. Soğutma ve etiketleme adımlarını takiben, hazne sürgüsünü yüzde beş CO2 içeren 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın. Ve hücreleri farklı zaman noktaları için inkübe edin.

Enfeksiyondan 30, 60 ve 90 dakika sonra hücreleri düzeltin. Bu zaman noktalarını, ilgili hücre tipine ve kullanılan floresan parçacıklarına göre optimize ettiğinizden emin olun. Ardından, ImageJ kullanarak görüntüleri analiz edin.

Başarılı alım, bir fagositin sitoplazması içindeki bir partikülün tamamen içselleştirilmesi ile karakterize edilir. Başlamak için, 37 santigrat dereceye kadar ısıtarak ve odayı yüzde 5 CO2 ile dengeleyerek bir mikroskop aşaması çevre odası hazırlayın. Görüntülemeden önce sıcaklığın ve CO2'nin stabilize olması için 30 ila 45 dakika bekleyin.

CO2 ve sıcaklık seviyelerini görmek, fagositoz için kritik öneme sahiptir, o odanın ortamını dengelemek için deneyden önce mikroskop ısıtıcısını açmak da önemlidir. Daha sonra, bağlanma tahlilinde gösterildiği gibi eksprese mCherry F-aktin'i stabilize eden DC 2.4 hücreli oda slaytları hazırlayın. Soğutma ve etiketleme adımlarını takiben, hazne sürgüsünü santrifüjden doğrudan önceden ısıtılmış bir mikroskop aşamasına aktarın.

Son olarak, yalnızca F-aktin ağının hareketini ve dinamiklerini yakalamak için değil, aynı zamanda canlı hücreler içindeki farklı fagositik olayları görselleştirmek için ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak canlı görüntüleme gerçekleştirin. Burada yeşil renkle gösterilen hücreler, kırmızı ile gösterilen Kanada BFP'si ile enfekte olmuş vahşi tip bir DC 2.4 hücresidir. Timelapse görüntüleme, fagositozun erken aşamalarını görselleştirmek için kullanılır ve burada 30 saniyelik aralıklarla gösterilir.

Yıldız işaretiyle gösterilen konumlar, aktin yeniden şekillenmesinin meydana geldiği yerlerdir. Tüm süreç birkaç dakika içinde gerçekleşir. Burada sfingolipidlerin rolü, fagositozun erken evrelerindeki rolleri açısından değerlendirildi.

Bu teknik kullanılarak, sfingolipidlerin candida albicans'ın hücrelere bağlanması ve genel fagositozun azaltılması için gerekli olduğu bulundu. Fagositotik bağlanmadaki bu azalma, DC 2.4 hücresinin zimozanlara bağlanması için de gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, fagositozun erken evresini incelemek için canlı görüntülemenin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir ila iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, bağışıklık hücreleri ile bu patojenler arasındaki karmaşık ilişkiyi anlamak için bakteriler ve parazitler de dahil olmak üzere diğer patojenlerin fagositozu gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, fagositoz ve bağışıklık hücrelerinde makropinositoz dahil olmak üzere reseptör aracılı endositozu keşfetmelerinin yolunu açtı.