RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

Bu prosedürün genel amacı, tirozin hidroksilaz güdümlü eGFP ekspresyonu, tek hücre toplama ve RNA dizileme kütüphanesi oluşturma kullanarak orta beyin kültürlerinde canlı dopaminerjik nöronları güvenilir bir şekilde tanımlamaktır. Bu yöntem, Parkinson hastalığı ve uyuşturucu bağımlılığı alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, çünkü kültürde tanımlanmış canlı dopaminerjik nöronlar üzerinde gen ekspresyonu ve elektrofizyolojik testler yapmayı mümkün kılar. Bu tekniğin avantajı, primer ventral mezensefalik kültürlerde sabit dopaminerjik nöronlardan ziyade canlı nöronları güvenilir bir şekilde tanımlamak için bir araç sağlamasıdır.

Prosedürün ilk bölümünü gösteren, Henry Lester'ın laboratuvarından bir teknisyen olan Charlene Kim olacak. Bir fare embriyosunun başını, burun üzerine sıkıca yerleştirilmiş forseps ile stabilize ederek başlayın, böylece sırt yüzeyine erişilebilir. Diğer yandan tutulan forsepsleri kullanarak, mezensefalonun sırtından hemen önce deri tabakasını ve kafatasını sıkıştırın ve cildi ve kafatasını orta hat boyunca dikkatlice soyun.

Forsepsleri bir ucu korteks ile mezonsefalon arasında, diğeri beyincik üzerinde olacak şekilde sırtın etrafına yerleştirin. Tüm orta beyni sıkıştırın ve çıkarın. Orta beyni, diseksiyon mikroskobu altında soğuk HBSS ile bir Petri kabına yerleştirin.

Diseksiyon mikroskobu altında, beyin segmentini ventral tarafa artık erişilebilir olacak şekilde çevirin. Şimdi görünen dört kadran var. Meninksleri forseps ile nazikçe kavrayarak ve beyinden yukarı doğru çekerek tüm meninksleri ve damar sistemini çıkarın.

Daha sonra, yaklaşık olarak segmentin ortasına ventrikül içine bir tonda forseps yerleştirin. Daha sonra orta beyni ayırmak için dorsal olarak bir tutam yapın ve ardından her iki tarafta medial olarak çimdikleyin. Her iki taraftan yanal kesimler yaparak alttaki iki çeyreği alın.

Ventral tegmental alan ve substantia nigra pars compacta, yoğun görünen ventral inferior bölümdedir. Hem VTA hem de SNC'yi içeren disseke edilmiş dokuyu taze HBSS'ye Petri kabının ayrı bir alanına yerleştirin. Tüm beyin segmentlerini inceledikten sonra, her bir orta beyin bölümünü yaklaşık olarak eşit büyüklükte parçalara ayırmak için forseps ve 11 numaralı neşter kullanın.

Ardından, dörde bölünmüş orta beyin segmentlerinin tümünü 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için geniş delikli bir P1000 pipet ucu kullanın. Dokunun yerleşmesine izin verdikten ve HBSS'yi çıkardıktan sonra, 500 mikrolitre papain solüsyonu ekleyin. 37 santigrat derece su banyosunda 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, sadece orta beyin segmentlerini bir mililitrelik DNaz I çözeltisine aktarmak için geniş çaplı bir P1000 ucu kullanın ve segmentlerin tüpün dibine çökmesine izin verin. Daha sonra, sadece orta beyin segmentlerini bir mililitre soğuk durdurma çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. İkinci durulamayı bir mililitre taze durdurma solüsyonu ile değiştirin ve hücreleri ezmek için bir P1000 pipet ucuyla yedi kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Ardından, 200 mikrolitre% 4 BSA çözeltisini tüpün dibine yavaşça pipetleyerek hücre süspansiyonunun altını yerleştirin. Altı dakika boyunca 280 x g'da santrifüjlemeden sonra, süpernatanı bir P1000 ile aspire edin ve hücreleri bir mililitre kaplama ortamında yeniden süspanse edin. Hemositometre kullanarak bir hücre sayımı yapın ve ardından hücre süspansiyonunu kaplama ortamı ile mikrolitre başına 1000 hücreye seyreltin.

Kaplamanın kurumamasını ve pürüzlü bir yüzey oluşturmamasını sağlamak için, laminin aspirasyonundan hemen sonra 120 mikrolitre hücre süspansiyonunu poli-D-lizin, poli-L-ornitin ve laminin kaplı kültür kaplarına yerleştirin. Daha sonra, bir saatlik inkübasyondan sonra, hücrelerin bozulmasını en aza indirmek için kültür kabının tohumlanmamış bir alanına dikkatlice üç mililitre kültür ortamı ekleyin. Üç haftalık kültürden sonra, kültür kabını iki mililitre RNaz içermeyen Dulbecco'nun PBS'si ile durulayın.

DPBS'yi çıkarın. Daha sonra hasat için bir mililitre taze DPBS ile değiştirin. Kültürlerdeki floresan TH pozitif nöronları tanımlamak için ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobunda GFP filtre setini ve 40X objektifini kullanın.

Mikromanipülatörü hücre soma üzerindeki pipete kullanın. Ardından, nöronu cam mikropipete aspire etmek için hafif emme uygulamak için mikropipet tutucunun yan portuna takılı plastik boru kullanın. Hücreyi içeren mikropipeti banyo solüsyonundan hemen çıkarın ve ucu reaksiyon tamponu içeren 0,2 mililter PCR tüpü koleksiyonunun içine yerleştirin.

Ucu tüpün dibe yakın tarafına doğru kırın. Daha sonra mikorpipetin arkasına steril bir 21 gauge şırınga iğnesi yerleştirin ve kalan sıvıyı mikropipetin kırık ucundan çıkarmak için basınç uygulayın. Toplama tüpünü bir masaüstü mikrosantrifüj kullanarak beş saniye santrifüjleyin ve ardından kuru buzda dondurun.

PCR kabininde reaktiflerle buz üzerinde veya bir soğutucu bloğu üzerinde çalışırken, ilk suş ana karışımını ve oda sıcaklığında %10 ek hacmi hazırlayın. Ve numuneye bir mikrolitre üç asal primer, bir ve bir mikrolitre niceliksel RNA Spikes. Daha sonra numuneyi termodöngüleyicide 72 santigrat derecede üç dakika inkübe edin ve ardından numuneleri doğrudan PCR soğutucu rafına koyun.

Daha sonra, hazırlanan ana karışımdan 5,5 mikrolitre bir PCR soğutucu rafındaki reaksiyon tüpüne ekleyin ve hafifçe pipetleyerek karıştırın. Tüpü beş saniye santrifüjledikten sonra, şimdi ekranda gösterilen parametrelere ayarlanmış bir termosiklerde inkübe edin. İlk iplikçik cDNA'sını saflaştırmak için, numuneye 25 mikrolitre girdaplı oda sıcaklığında manyetik boncuk ekleyin.

Tüm hacmi en az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Daha sonra cDNA'nın boncuklara bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında sekiz dakika inkübe edin. Ardından, numuneleri ve manyetik boncukları, sıvı tamamen berrak görünene ve süpernatantta boncuk kalmayana kadar manyetik ayırma cihazına yerleştirin.

Süpernatanı aspire edin ve atın. Sıvıyı tüpün yanından toplamak için numuneyi beş saniye döndürün. Numuneleri 30 saniye boyunca manyetik ayırma cihazına yerleştirin.

Ardından, yalnızca bağlı DNA'ya sahip boncukları bırakmak için kalan tüm süpernatanı P10 pipetleyici ile çıkarın. 50 mikrolitre ds-cDNA PCR ana karışımı ekleyin ve ardından çift sarmallı cDNA'yı elde etmek için ikinci sarmallı sentez PCR programını çalıştırın. Bu histogram, TH-eGFP pozitif hücrelerden üretilen tek hücreli dopaminerjik RNA dizileme kitaplıklarında tespit edilen protein kodlayan genlerin sayısını, eşlenen milyon okuma başına transkript kilotabanı başına parçalar halinde gösterir.

Tek hücre kütüphanelerinde 6.000 ila 8.000 protein geni tespit edildi. Bir kez ustalaştıktan sonra bu teknik, hücrelerin türetilmesi için geçen süre dahil olmak üzere dört ila beş hafta içinde yapılabilir, kültürdeki hücrelerin olgunlaşmasına izin verir, hücre toplama ve kütüphane oluşturma adımları, kütüphanelerin dizilimi ve ön analiz. Bu prosedürü denerken, RNA'nın kütüphane oluşturma ve hücre toplama arayışı için RNAz içermeyen bir çalışma alanı tutmayı, hücre kültürü boyunca steril teknikleri sürdürmeyi ve tek hücre toplama için uygun boyutta çapa sahip pipetler yapmayı unutmamak önemlidir.

Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve çeker ocak kullanmak, cilt ve göz temasından kaçınmak, ısıdan ve açık alevden uzak durmak ve uygun kişisel koruyucu giysi giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu prosedürü takiben, ilaç tedavilerinin dopaminerjik hücrelerde protein ekspresyonunu nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için gen ekspresyonu ve gen ağı analizi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.