Name: RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Öğrenin, fare embriyolarından ventral orta beyin kültürlerinde yaşayan dopaminerjik nöronları tirozin hidroksilaz promotörüyle yönlendirilen eGFP ifadesi kullanarak güvenilir bir şekilde nasıl tanımlayacağınızı. Bu yöntem, tek hücre hasadı ve RNA dizileme ile transkriptomik analiz için izole edilmiş nöronların incelenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (DA017279, AG033954, DA037743), Michael J. Fox Vakfı ve Kaliforniya Teknoloji Enstitüsü'ndeki Millard ve Muriel Jacobs Genetik ve Genomik Laboratuvarı'nı finanse eden Caltech İnovasyon Girişimi'nden alınan hibelerle desteklenmiştir. RNA-Seq kütüphane protokolünü optimize ettiği ve yardım sağladığı için Brian Williams'a teşekkür ederiz. Hesaplama eğitimi için Henry Amrhein'e teşekkür ederiz. Barbara J.W.'ye ekipmanlarını ve laboratuvar alanını kullandığı için teşekkür ederiz. Kütüphane sıralaması ve tesis yönetimi için Igor Antoshechkin'e teşekkür ederiz.

<ol><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+nicotine+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).</li>
<li>Marinov, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single-cell+to+cell-pool+transcriptomes%3A+stochasticity+in+gene+expression+and+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing.</a> Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+reveals+dynamic+changes+in+lncRNA+expression+during+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li>
<li>Gertz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposase+mediated+construction+of+RNA-seq+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Transposase mediated construction of RNA-seq libraries.</a> Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).</li>
<li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. , 562-578 (2012).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs%2C+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry%2C+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency%2C+and+Prevents+Nicotine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubator+embedded+cell+culture+imaging+system+%28EmSight%29+based+on+Fourier+ptychographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy.</a> Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).</li>
<li>Lammel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+transgenic+mouse+models+for+selective+targeting+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons.</a> Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dryanovski, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+entry+and+alpha-synuclein+inclusions+elevate+dendritic+mitochondrial+oxidant+stress+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons.</a> J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).</li>
<li>Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Regulation+of+Action+Potential+Shape+and+Burst-Frequency+Firing+by+BK+and+Kv2+Channels+in+Substantia+Nigra+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons.</a> J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

İşte biz o tek hücre RNA seq ile her hücreyi çalışma, bir floresan etiketi kullanarak heterojen bir nüfus tek hücreleri izole. Biz hasat edilmiş ve dizilenmiştir canlı TH EGFP hücrelerinin% 100 aşağıdaki üç DA-ilişkili gen transkriptleri, Th, DDC ve slc6a3 varlığına dayanarak, gerçekten de dopaminerjik nöronların olduğunu rapor etmektedir. RNA Sek tarafından değerlendirilen TH-eGFP pozitif hücrelerin bu üç gen ifade etti. Bu, her bir TH-eGFP hücresi dopaminerjik nöronlar 8, <sup class=...

Parkinson Hastalığı (PH) çaresiz bir, yaşa bağlı nörodejeneratif bir hastalıktır. Bu nispeten yaygın hastalığın nedeni tam olarak anlaşılamamıştır kalır. bradikinezi, katılık ve titreme tanısal klinik özelliklerine lider Substansiya Nigra (SNC) dopaminerjik nöronların belirgin nöron dejenerasyonu ile beynin genelinde yaygın nöron kaybı, vardır. SNc dopaminerjik nöron içeren primer karma kültürler Parkinson hastalığı için, özellikle önemlidir. Ventral Tegmental Alanı (VTA) dopaminerjik nöronların ödül ve bağımlılık sorumlu tutulmuştur. Ventral Mesensefalik (VM) primer karma embriyonik kültürleri SNc ve VTA dopaminerjik (DA) nöronlar ve GABAerjik nöronlar ikisini de içerir. VM birincil kültürleri nöroprotektif tahlilleri için yararlı olabilir ve dopaminerjik nöronların seçici güvenlik aydınlatmak için. morfolojisi dayalı kültür dopaminerjik hücrelerin belirlemek için güvenilir bir yolu yoktur. obiz tek hücreli, yüksek verim RNA sıralama kütüphaneleri belirlemek ve tek dopaminerjik nöronların hasat ve inşa teknikleri geliştirmek yeniden. Biz tek dopaminerjik ve orta beyin kültürlerinden izole edilen GABAerjik nöronlar için temsili RNA transcriptome rapor verilerini. Bu protokol, DA / GABA transcriptome çeşitli tedavilerin etkisini incelemek için nöro-koruma, nörodejenerasyon, ve farmakolojik tahliller için de kullanılabilir. dopaminerjik nöronlar primer VM kültürlerinde ifade nöronların küçük bir azınlığı temsil ettikleri için, güvenilir yaşayan kültürlerde bu nöronlar tanımlamak için yeteneği tek hücreli çalışmalarının gelişmiş bir dizi sağlayacaktır. Bu yeni teknikler hücresel düzeyde gerçekleşen mekanizmaların anlaşılması gelişmeler kolaylaştıracak ve başka bir yerde nörobilim ve moleküler biyoloji alanlarında uygulamalar olabilir.

<table><tbody><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biyokimya Şirketi&nbsp;</td><td></td><td></td>LS003126</tr><tr><td>Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 1x</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Donör At Serumu</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma&nbsp;</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Ortam: Nörobazal ortam</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Stabilize edilmiş bir L-glutamin, L-alanil-L-glutamin formu içeren kültür ortamı: GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td>0.5 mM nihai konsantrasyon.</td></tr><tr><td>L-Askorbik asit</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504-044</td><td>50x stok çözeltisi, 1x nihai konsantrasyon.</td></tr><tr><td>35 mm cam tabanlı tabaklar</td><td>MatTek&nbsp; &nbsp;</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L2020</td><td>-20 ° C'de saklanır; 20'de C ve mikro; L alikotları</td></tr><tr><td>Deoksiribonükleaz I (DNaz)</td> <td>Sigma&nbsp;</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Mavi pipet uçları P1000</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>&nbsp;Inc. 10130</td><td></td></tr><tr><td>10 mm sığ Petri kabı</td><td>VWR&nbsp;</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>37 & derece; C Su banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 & derece; C, %5 nem inkübatörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%16 paraformaldehit (PFA)</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Eşek serumu</td><td>Equitech&nbsp;</td><td>SD-0100HI</td><td>%100 stok çözeltisi, %1 nihai konsantrasyon.</td></tr><tr><td>Standart Desen cerrahi makas</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>14000-14</td><td></td></tr><tr><td>Forseps - 2x3 diş</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>Forseps - Dumont #55</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Forseps - Dumont #5</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat tamponlu çözeltisi (DPBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>21 G iğne</td><td>BD PrecisionGlide İğne</td><td></td><td>305167 100 iğne</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme Sutter</td><td>Alet</td><td>modeli P-87</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör&nbsp;</td><td>Sutter Enstrümanı</td><td>&nbsp; MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Kiti: Illumina Dizileme için SMARTer Ultra Düşük RNA Kiti</td><td>Clontech</td><td>634936</td><td>100 rnxs, Advantage2PCR Kiti</td></tr><tr><td>oligonükleotid dahil (12 ve mikro; M): SMARTer IIA oligonükleotid (12 & mikro; M)</td><td></td><td></td> <td>SMARTer Kitinden ></td></tr><tr><td>Ters transkriptaz (100 ünite)</td><td>SMARTcribe ters transkriptaz</td><td></td><td>SMARTer Kitinden &nbsp;</td></tr><tr><td>Astar 1</td><td>3' CDSIIa astarı&nbsp;</td><td></td><td>SMARTer Kitinden</td></tr><tr><td>Primer 2</td><td>IS PCR astarı</td><td></td><td>SMARTer Kitinden</td></tr><tr><td>50x 2 polimeraz karışımı</td><td>50x Avantaj 2 polimeraz karışımı</td><td></td><td>SMARTer Kitinden</td></tr><tr><td>10x PCR tamponu 10x Avantaj</td><td>2 PCR tamponu</td><td></td><td>SMARTer Kitinden</td></tr><tr><td>RNA Sivri Uçları</td><td>ThermoFisher</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>PCR soğutucu raf</td><td>IsoFreeze PCR soğutucu raf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Örnek Hazırlama Kiti&nbsp;</td><td>(Illumina/Nextera) Nexter</td><td>FC-121-1030</td><td>24 Örnek</td></tr><tr><td>PCR ana karışımı</td><td>Nextera PCR ana karışımı (NPM)</td><td></td><td>Nextera Kitinden ></td></tr><tr><td>PCR primer kokteyli (PPC)&nbsp;</td><td>Nextera PCR primer kokteyli (PPC)&nbsp;</td><td></td><td>Nextera Kiti</td></tr><tr><td>Florometreden</td><td>Qubit ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>HS DNA BioAnalyzer kiti</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>110 rxns</td></tr><tr><td>Elektroforez sistemi&nbsp;</td><td>Agilent 2100 Biyoanalizör.</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik boncuklar: Agencourt AMPure&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>RNAse silme: RNAse Zap mendiller</td><td>Ambion</td><td>AM9786</td><td>Boyut 100 Yaprak</td></tr><tr><td>Qubit ds HS Test</td><td>Kiti Moleküler problar&nbsp;</td><td>Q32854</td><td>500 tahlil</td></tr><tr><td>Jel ekstraksiyon kiti: Qiaquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal boru</td> <td>(Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm OD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige (veya eşdeğeri)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıralayıcı</td><td>Illumina HiSeq cihazı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENSAT tirozin hidroksilaz-eGFP fare suşu&nbsp;</td><td></td><td>MMRRC stok numarası: 000292-UNC</td><td>Stok Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Fare Bölgesel Araştırma Merkezi</td></tr></tbody></table>

rna sıralaması ve th-organizatörü odaklı egfp İfade kullanımı orta beyin kültürlerde yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir kimlik

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

<html> Parkinson Hastalığı (PH) bradikinezi, katılık ve titreme neden, Snc dopaminerjik nöronların belirgin dejenerasyon ile beynin genelinde yaygın nöronal kaybı vardır. floresan işaretleyici kullanarak birincil Ventral Mesensefalik (VM) kültürlerde yaşayan dopaminerjik nöronların belirlenmesi sabit hücrelerin immün dayanmadan bu nöronların seçici açığı incelemek için alternatif bir yol sağlar. Burada, izole, ayrışır ve kültür fare VM nöronlar 3 hafta boyunca. Daha sonra (bir tirosin hidroksilaz (TH) promoteri tarafından tahrik edilen) EGFP floresan kullanılarak kültürler dopaminerjik nöronların tanımlar. Bireysel nöronlar cam mikropipetler kullanarak mikrosantrifüj tüpler içine hasat edilir. Sonra, hasat edilen hücreler lize ve tek bir hücre RNA Seq kitaplıkları da 1, 2 üretmek için cDNA sentezi ve transpozon aracılı &quot;tagmentation&quot; yapmak,eşek = &quot;xref&quot;&gt; 3, 4, 5. Bir kalite kontrol kontrolünü geçtikten sonra tek hücreli kütüphaneleri sekanslanır ve sonraki analiz gen ekspresyonunu ölçmek için gerçekleştirilir. Biz bireysel dopaminerjik ve orta beyin kültürlerinden izole edilen GABAerjik nöronlar için transcriptome sonuçlarını rapor. Bu hasat edilmiştir ve dizilenmiştir canlı TH EGFP hücrelerinin% 100 dopaminerjik nöronların olduğunu rapor etmektedir. Bu teknikler nörobilim ve moleküler biyoloji yaygın uygulamalara sahip olacaktır.

Burada, bir tirosin hidroksilaz promotör sekansı ile tahrik eGFP eksprese eden bir fare ön orta beyin nöronları kültür kültürlerden bağımsız flüoresan nöronlar hasat ve RNA SEQ (Şekil 1) kullanılarak, RNA transcriptome ölçmek için bir protokolü sunulmaktadır. veriler toplandı ve dizilenmiştir TH-EGFP-pozitif hücre% 100 aşağıdaki üç DA-ilişkili gen kopyalarının varlığı, Th, dopa dekarboksilaz (DDC), ve dopamin transportörü DAT göre, dopaminerjik nöronların olduğunu göster...

Parkinson Hastalığı (PH), Substansiya Nigra (SNC) dopaminerjik nöronların, motor disfonksiyon neden dejenere. Burada, bir tirosin hidroksilaz (TH) yükseltici sırası ile tahrik EGFP ifade bir fareden ön orta beyin nöronları kültür kültürlerden bağımsız flüoresan nöronlar hasat ve RNA SEQ kullanarak transcriptome ölçmek için bir protokolü sunulmaktadır.

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Bu prosedürün genel amacı, tirozin hidroksilaz güdümlü eGFP ekspresyonu, tek hücre toplama ve RNA dizileme kütüphanesi oluşturma kullanarak orta beyin kültürlerinde canlı dopaminerjik nöronları güvenilir bir şekilde tanımlamaktır. Bu yöntem, Parkinson hastalığı ve uyuşturucu bağımlılığı alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, çünkü kültürde tanımlanmış canlı dopaminerjik nöronlar üzerinde gen ekspresyonu ve elektrofizyolojik testler yapmayı mümkün kılar. Bu tekniğin avantajı, primer ventral mezensefalik kültürlerde sabit dopaminerjik nöronlardan ziyade canlı nöronları güvenilir bir şekilde tanımlamak için bir araç sağlamasıdır.Prosedürün ilk bölümünü gösteren, Henry Lester'ın laboratuvarından bir teknisyen olan Charlene Kim olacak. Bir fare embriyosunun başını, burun üzerine sıkıca yerleştirilmiş forseps ile stabilize ederek başlayın, böylece sırt yüzeyine erişilebilir. Diğer yandan tutulan forsepsleri kullanarak, mezensefalonun sırtından hemen önce deri tabakasını ve kafatasını sıkıştırın ve cildi ve kafatasını orta hat boyunca dikkatlice soyun.Forsepsleri bir ucu korteks ile mezonsefalon arasında, diğeri beyincik üzerinde olacak şekilde sırtın etrafına yerleştirin. Tüm orta beyni sıkıştırın ve çıkarın. Orta beyni, diseksiyon mikroskobu altında soğuk HBSS ile bir Petri kabına yerleştirin.Diseksiyon mikroskobu altında, beyin segmentini ventral tarafa artık erişilebilir olacak şekilde çevirin. Şimdi görünen dört kadran var. Meninksleri forseps ile nazikçe kavrayarak ve beyinden yukarı doğru çekerek tüm meninksleri ve damar sistemini çıkarın.Daha sonra, yaklaşık olarak segmentin ortasına ventrikül içine bir tonda forseps yerleştirin. Daha sonra orta beyni ayırmak için dorsal olarak bir tutam yapın ve ardından her iki tarafta medial olarak çimdikleyin. Her iki taraftan yanal kesimler yaparak alttaki iki çeyreği alın.Ventral tegmental alan ve substantia nigra pars compacta, yoğun görünen ventral inferior bölümdedir. Hem VTA hem de SNC'yi içeren disseke edilmiş dokuyu taze HBSS'ye Petri kabının ayrı bir alanına yerleştirin. Tüm beyin segmentlerini inceledikten sonra, her bir orta beyin bölümünü yaklaşık olarak eşit büyüklükte parçalara ayırmak için forseps ve 11 numaralı neşter kullanın.Ardından, dörde bölünmüş orta beyin segmentlerinin tümünü 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için geniş delikli bir P1000 pipet ucu kullanın. Dokunun yerleşmesine izin verdikten ve HBSS'yi çıkardıktan sonra, 500 mikrolitre papain solüsyonu ekleyin. 37 santigrat derece su banyosunda 15 dakika inkübe edin.İnkübasyonun ardından, sadece orta beyin segmentlerini bir mililitrelik DNaz I çözeltisine aktarmak için geniş çaplı bir P1000 ucu kullanın ve segmentlerin tüpün dibine çökmesine izin verin. Daha sonra, sadece orta beyin segmentlerini bir mililitre soğuk durdurma çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. İkinci durulamayı bir mililitre taze durdurma solüsyonu ile değiştirin ve hücreleri ezmek için bir P1000 pipet ucuyla yedi kez yukarı ve aşağı pipetleyin.Ardından, 200 mikrolitre% 4 BSA çözeltisini tüpün dibine yavaşça pipetleyerek hücre süspansiyonunun altını yerleştirin. Altı dakika boyunca 280 x g'da santrifüjlemeden sonra, süpernatanı bir P1000 ile aspire edin ve hücreleri bir mililitre kaplama ortamında yeniden süspanse edin. Hemositometre kullanarak bir hücre sayımı yapın ve ardından hücre süspansiyonunu kaplama ortamı ile mikrolitre başına 1000 hücreye seyreltin.Kaplamanın kurumamasını ve pürüzlü bir yüzey oluşturmamasını sağlamak için, laminin aspirasyonundan hemen sonra 120 mikrolitre hücre süspansiyonunu poli-D-lizin, poli-L-ornitin ve laminin kaplı kültür kaplarına yerleştirin. Daha sonra, bir saatlik inkübasyondan sonra, hücrelerin bozulmasını en aza indirmek için kültür kabının tohumlanmamış bir alanına dikkatlice üç mililitre kültür ortamı ekleyin. Üç haftalık kültürden sonra, kültür kabını iki mililitre RNaz içermeyen Dulbecco'nun PBS'si ile durulayın.DPBS'yi çıkarın. Daha sonra hasat için bir mililitre taze DPBS ile değiştirin. Kültürlerdeki floresan TH pozitif nöronları tanımlamak için ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobunda GFP filtre setini ve 40X objektifini kullanın.Mikromanipülatörü hücre soma üzerindeki pipete kullanın. Ardından, nöronu cam mikropipete aspire etmek için hafif emme uygulamak için mikropipet tutucunun yan portuna takılı plastik boru kullanın. Hücreyi içeren mikropipeti banyo solüsyonundan hemen çıkarın ve ucu reaksiyon tamponu içeren 0,2 mililter PCR tüpü koleksiyonunun içine yerleştirin.Ucu tüpün dibe yakın tarafına doğru kırın. Daha sonra mikorpipetin arkasına steril bir 21 gauge şırınga iğnesi yerleştirin ve kalan sıvıyı mikropipetin kırık ucundan çıkarmak için basınç uygulayın. Toplama tüpünü bir masaüstü mikrosantrifüj kullanarak beş saniye santrifüjleyin ve ardından kuru buzda dondurun.PCR kabininde reaktiflerle buz üzerinde veya bir soğutucu bloğu üzerinde çalışırken, ilk suş ana karışımını ve oda sıcaklığında %10 ek hacmi hazırlayın. Ve numuneye bir mikrolitre üç asal primer, bir ve bir mikrolitre niceliksel RNA Spikes. Daha sonra numuneyi termodöngüleyicide 72 santigrat derecede üç dakika inkübe edin ve ardından numuneleri doğrudan PCR soğutucu rafına koyun.Daha sonra, hazırlanan ana karışımdan 5,5 mikrolitre bir PCR soğutucu rafındaki reaksiyon tüpüne ekleyin ve hafifçe pipetleyerek karıştırın. Tüpü beş saniye santrifüjledikten sonra, şimdi ekranda gösterilen parametrelere ayarlanmış bir termosiklerde inkübe edin. İlk iplikçik cDNA'sını saflaştırmak için, numuneye 25 mikrolitre girdaplı oda sıcaklığında manyetik boncuk ekleyin.Tüm hacmi en az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Daha sonra cDNA'nın boncuklara bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında sekiz dakika inkübe edin. Ardından, numuneleri ve manyetik boncukları, sıvı tamamen berrak görünene ve süpernatantta boncuk kalmayana kadar manyetik ayırma cihazına yerleştirin.Süpernatanı aspire edin ve atın. Sıvıyı tüpün yanından toplamak için numuneyi beş saniye döndürün. Numuneleri 30 saniye boyunca manyetik ayırma cihazına yerleştirin.Ardından, yalnızca bağlı DNA'ya sahip boncukları bırakmak için kalan tüm süpernatanı P10 pipetleyici ile çıkarın. 50 mikrolitre ds-cDNA PCR ana karışımı ekleyin ve ardından çift sarmallı cDNA'yı elde etmek için ikinci sarmallı sentez PCR programını çalıştırın. Bu histogram, TH-eGFP pozitif hücrelerden üretilen tek hücreli dopaminerjik RNA dizileme kitaplıklarında tespit edilen protein kodlayan genlerin sayısını, eşlenen milyon okuma başına transkript kilotabanı başına parçalar halinde gösterir.Tek hücre kütüphanelerinde 6.000 ila 8.000 protein geni tespit edildi. Bir kez ustalaştıktan sonra bu teknik, hücrelerin türetilmesi için geçen süre dahil olmak üzere dört ila beş hafta içinde yapılabilir, kültürdeki hücrelerin olgunlaşmasına izin verir, hücre toplama ve kütüphane oluşturma adımları, kütüphanelerin dizilimi ve ön analiz. Bu prosedürü denerken, RNA'nın kütüphane oluşturma ve hücre toplama arayışı için RNAz içermeyen bir çalışma alanı tutmayı, hücre kültürü boyunca steril teknikleri sürdürmeyi ve tek hücre toplama için uygun boyutta çapa sahip pipetler yapmayı unutmamak önemlidir.Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve çeker ocak kullanmak, cilt ve göz temasından kaçınmak, ısıdan ve açık alevden uzak durmak ve uygun kişisel koruyucu giysi giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu prosedürü takiben, ilaç tedavilerinin dopaminerjik hücrelerde protein ekspresyonunu nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için gen ekspresyonu ve gen ağı analizi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

reliable-identification-living-dopaminergic-neurons-midbrain-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

E12.5 fare embriyonik Ortabeyin Organotipik dilimler oluşturmak için bir yöntem açıklanmıştır. Organotipik dilim kültürleri dopaminerjik nöronlar veya diğer ventral orta beyin nöronları davranışını gözlemlemek için kullanılabilir.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem...

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Burada dopaminerjik (DA) nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kurulmuştur iki deneyleri...

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün

Dopaminerjik nöronlar beyinde hayati bir düzenleyici rol oynar. Kayıpları Parkinson hastalığı ile ilişkilidir. Bu videoda, embriyonik fare mezensefalondan merkezi dopaminerjik nöronların birincil kültürlerinin nasıl oluşturulacağını gösteriyoruz. Bu tür kültürler, bu nöronların çeşitli streslere karşı aşırı savunmasızlığını incelemek için yararlıdır.

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Parkinson hastalığı sırasında orta beyin dopaminerjik nöronlarının dejenerasyonunun nedenleri tam olarak anlaşılamamıştır. Hücresel kültür sistemleri, bu nöronların nörofizyolojik özelliklerinin incelenmesi için önemli bir araç sağlar. Burada, nörodejenerasyonun in vitro modellemesi için kullanılabilecek optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Dopamin D1-Alfa reseptör nucleus accumbens tanımlaması D1 reseptör disfonksiyonu bir merkezi sinir sistemi hastalığı sırasında açıklığa kavuşturulması için önemlidir. Biz bir belirli beyin bölgesinde tek RNA molekülleri görselleştirmek için bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil yapılır.

Dopamin D1-Alfa reseptör kemirgen Nucleus Accumbens bir yenilikçi RNA Situ içinde hafiye teknoloji tarafından içinde tanımlaması

Kültürlü Drosophila beyin eksplantlarında sessiz nöral kök hücreleri yeniden aktive etmek için bir yöntem oluşturulmuştur. Bu yöntem kullanılarak, nöral kök hücre sessizliğinin, giriş ve çıkışın düzenlenmesinde sistemik sinyallerin rolü doku-intrinsik sinyallerden ayrılabilir.

Kültürlü Drosophila Beyin Eksplantlarında Nöral Kök Hücre Reaktivasyonu

Bu protokol, insan orta beyin dopaminerjik nöronlarının hücre kültürünü, ardından immünolojik boyamayı ve genetik veya kimyasal modülasyonlara bağlı fenotipik varyasyonların tanımlanmasına izin veren elde edilen mikroskobik yüksek içerikli görüntülerden nöronal fenotipik profillerin oluşturulmasını tanımlar.

İnsan Kök Hücre Kaynaklı Orta Beyin Dopaminerjik Nöronlarının Fenotipik Profillemesi

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Bu çalışma, gözenekli membran insertleri kullanarak aksonal mRNA'ları izole etmek için sağlam bir yöntem sunmaktadır; böylece toplam nöron ve nörit ayrımı ve RNA arındırmasını mümkün kılar. RTddPCR ile birleştiğinde, bu yaklaşım düşük kopyalı transkriptlerin mutlak nicelendirilmesini sağlar; mRNA taşınımı ve yerel çeviri çalışmalarını yüksek duyarlılık, tekrarlanabilirlik ve geniş deneysel uygulama ile kolaylaştırır.

Gözenekli Membran Insertleri ve RTddPCR Kullanarak Aksonal MRNA'ların İzolasyonu ve Nicelesi

Öğrenin, fare embriyolarından ventral orta beyin kültürlerinde yaşayan dopaminerjik nöronları tirozin hidroksilaz promotörüyle yönlendirilen eGFP ifadesi kullanarak güvenilir bir şekilde nasıl tanımlayacağınızı. Bu yöntem, tek hücre hasadı ve RNA dizileme ile transkriptomik analiz için izole edilmiş nöronların incelenmesini sağlar.

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik (Video) | JoVE Journal

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

Daha fazla video keşfet