Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe sitokinezi incelemek için mükemmel bir model sistemi, hücre bölünmesi son aşamasıdır. Burada canlı fisyon maya hücreleri farklı cytokinetic olayları analiz etmek için bir mikroskop yaklaşım açıklar.

Bu canlı hücre mikroskobu tekniğinin genel amacı, fisyon mayası model sisteminde sitokinez sırasında meydana gelen uzay-zamansal olayları incelemektir. Bu yöntem, zaman içinde sitokinezin farklı aşamalarının moleküler ayrıntıları gibi sitokinetik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, sitokinetik makinenin farklı mekansal bileşenlerinin, hücrelere minimum toksisite ile uzun süreler boyunca analiz edilebilmesidir.

Bu yöntem sitokinez ve fisyon mayası hakkında bilgi sağlayabilse de, tomurcuklanan maya ve diğer mantarlara da uygulanabilir. Bu işleme başlamak için, C vitamini ile bağlanmış üç ila dört mililitre erimiş ortamı cam tabanlı bir kültür kabına dökün. Ortam katılaştıktan sonra, ortam levhasını kültür kabından nazikçe kaldırmak için keskin bir neşter kullanın ve levhanın tabağa geri düşmesini önlemek için medya levhası ile kültür kabı arasına bir pipet ucu yerleştirin.

Daha sonra, ortam levhası ile kültür kabının cam tabanı arasına iki ila beş mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre kültürü yükleyin. Ardından pipet ucunu çok nazikçe çıkarın ve medya levhasını kültür kabı üzerindeki orijinal konumuna geri yerleştirin. Kültür kabındaki hücreleri, mikroskobun yapılacağı sıcaklıkta karanlıkta 30 dakika ila bir saat boyunca inkübe edin.

Hücreler görüntüleme için hazır olduğunda, kültür kabının üzerindeki camın dış tarafına bir damla yabani hayvan koyun. Kültür kabını ters çevrilmiş bir mikroskoba yerleştirin. Hücrelerin medial düzlemine odaklanın ve iyi aralıklı olduklarından ve çok kalabalık olmadıklarından emin olun.

Hücrelerin görüntü alımına hücre döngüsünün uygun bir aşamasında başladığınızdan emin olun. Bu deneyde, geç G2'dir. Ardından, görüntü alma yazılımını programlayın. DIC için pozlama süresini 100 milisaniye olarak ayarlayın.

GFP ve RFP filtreleri için 75 milisaniyelik pozlama süreleri kullanın. Lazer gücünü %50'ye ayarlayın, ancak bunun bireysel deneye bağlı olarak değişeceğini unutmayın. Görüntüleri üç boyutlu olarak yakalamak için, yazılımı Z serisini elde edecek şekilde programlayın.

Toplam 4.0 mikrometre Z mesafesi için zaman noktası başına 16 Z karesinin yakalanması için hücrelerin merkezi odak noktası etrafında maksimum 6 mikrometre adım boyutunun ve 6 mikrometre mesafenin kullanılması. Bu parametreler hücrenin kalınlığına göre değiştirilebilir. Programı her iki dakikada bir görüntü çekecek şekilde ayarlayın.

Deneyin gereksinimlerine göre maruz kalma süresini seçin. Bu örnekte 75 milisaniye kullanılmıştır. Yazılımı, alımı 90 dakika sonra durduracak şekilde programlayın.

Ve sonra görüntü alımını başlatın. Görüntüyü analiz etmek için ImageJ yazılımı kullanılır. Başlamak için, dalga boylarının her biri için görüntü serisini açın.

Çalışılacak bir hücre seçin. Çizgi genişliğini ayarlamak üzere başka bir pencere açmak için araç çubuğunun çizgi seçeneğine çift tıklayın. Çizgi genişliğini, vahşi türdeki bir hücre için yaklaşık 40 - 50 piksel olan hücre genişliğine karşılık gelecek şekilde ayarlayın.

İlgilenilen hücrenin uzun ekseni boyunca bir çizgi çizin. Analiz et'e, ardından araçlara, ardından ROI yöneticisine ve ardından ekle'ye tıklayın. Bu, seçilen satırı daha sonra kullanmak üzere ROI penceresine ekleyecektir.

Bu pencereyi kapatmayın. İlgilendiğiniz resme tıklayın, ardından düzenle'yi, ardından seçimi ve ardından düzelt'i seçin. Hücreyi yatay olarak düzeltmek için tüm yığını kontrol edin.

Görüntüye tıklayın, ardından dönüştürün, ardından görüntüyü dikey olarak düzeltmek için 90 derece sağa döndürün. Resme tıklayın, ardından yığınlayın ve ardından montajı yapın. Bu, yığın için satır ve sütun sayısını, görüntü boyutu için ölçek faktörünü, montaj için ilk ve son dilim veya kareyi ve montaj için kare artışını atamak için bir pencere açacaktır.

Etiket dilimlerini kontrol edin ve enter tuşuna basın. İlgilenilen hücrenin montajını içeren bir pencere gösterildiğinde, diğer dalga boyu için görüntü serisini açın. ROI yöneticisinde, ikinci görüntü dosyasında aynı hücreyi seçmek için satır tanımlayıcısına tıklayın.

İkinci görüntünün montajını açmak için önceki adımları yineleyin. Mil direği gövdesi işaretleyicisi Sad1-mCherry ile görüntüde, iş mili kutup gövdesi işaretleyicisinin ayrılmasını arayın ve bu zaman noktasını sıfır zamanı olarak işaretleyin. Zaman içinde görüntüdeki halka proteini Rlc1-domatesin sinyalini takip edin ve Rlc1-domates yamalarının aksine belirgin bir çizgi olarak görünen sinyali arayın.

Bu zaman noktası, aktomiyosin halkası montajının tamamlandığını veya olgunlaşma aşamasının başlangıcını işaret eder. Ardından, Rlc1 domates halkasının boyutunun ne zaman küçülmeye başladığını belirlemek için zaman içinde filmde gezinin. Bu, olgunlaşma aşamasının sonu veya halka daralmasının başlangıcı olarak işaretlenir.

Hücre ekseninin ortasında bir nokta olarak görünene kadar daralma boyunca zaman içinde Rlc1-domates sinyalini takip edin. Bu, halka daralmasının sonu veya septum girişinin sonu olarak işaretlenir. DIC görüntülerinin montajını takiben, absisyonun ne zaman tamamlandığını belirleyin.

Hücrelerin fiziksel olarak ayrıldığı zaman noktasını kaydedin. Bu analize, görünür bir aktomiyosin halkası olan bir hücre seçerek başlayın. ImageJ araç çubuğunun satır seçeneğine çift tıklayın.

Çizgi genişliğini, yaklaşık 15 ila 20 piksel halka kalınlığına karşılık gelecek şekilde ayarlayın. Halkanın tüm kalınlığının dahil edildiğinden emin olarak halka boyunca bir çizgi çizin. Analize, ardından araçlara, ardından ROI Yöneticisi'ne tıklayın ve ekle'ye tıklayın.

Bu, seçim satırını daha sonra kullanmak üzere ROI penceresine ekleyecektir. Bu pencereyi kapatmayın. İlgilendiğiniz resme tıklayın ve düzenle'yi, ardından seçimi ve ardından düzelt'i seçin.

Halkayı yatay olarak düzeltmek için tüm yığını kontrol edin. Görüntüyü kullanarak düzleştirme Z yığınındaki en parlak düzlemin yoğunluğunu sıfırlayın, ardından ayarlayın, ardından parlaklığı ve kontrastı ayarlayın, ardından sıfırlayın. Sekmeye tıklayın SGK sonra 3D proje bir diyalog kutusu açmak için.

Projeksiyon yöntemini en parlak nokta ve dilim aralığı olarak iki ila üç piksel olarak değiştirin. Son olarak, istenen görüş açısına bağlı olarak dönme eksenini X veya Y ekseni olarak değiştirin. Enterpolasyon'a tıklayın ve görüntünün 3B projeksiyonunu oluşturmak için Tamam'a tıklayın.

Görüntüyü döndürmek için görüntünün altındaki kaydırma çubuğunu kullanın. Ardından, diğer dalga boyu için görüntü serisini açın. İkinci görüntü dosyasında aynı halkayı seçmek için ROI yöneticisindeki satır tanımlayıcısına tıklayın.

Görüntüdeki bir 3B halkayı diğer dalga boyuyla açmak için önceki adımları tekrarlayın. Her iki 3B görüntü halkası açıkken, görüntüye, ardından renge ve ardından kanalları birleştirmeye tıklayın. İstediğiniz ilgili renk için açılır menüden her bir görüntüyü seçin ve Tamam'a tıklayın. Sitokinetik halka veya giriş membranındaki lokalizasyon ile ilgili olarak farklı belirteçlerin lokalizasyonunu karşılaştırın.

Sitokinez sırasında iğ kutbu gövde markörü, Sad1-mCherry ve halka markörü Rlc1-GFP'de eksprese edilen fisyon maya hücreleri görüntülendi. Mil kutup gövdesi ayrılması, sıfır zamanı olarak belirlenen 17 dakikada gerçekleşti. Rlc1-GFP, mil direği gövdesi ayrılmasından dört dakika önce bölme bölgesinde görünür.

Mil kutup gövdesi ayrıldıktan sonra, halka olgunlaşması on dakikada başlar. Halka daralması 31 dakikada başlar ve 53 dakikada sona erer. Son olarak, mil kutup gövdesi ayrılmasından 80 dakika sonra hücre absisyonu meydana gelir.

Önceki görüntülerde belirlenen sitokinetik olayların zaman çizelgesi, mil kutbu gövde işaretleyicileri arasındaki mesafe tarafından belirlenen mitoza referansla bir grafikte çizilebilir. Sitokinez boyunca bölünme bölgesindeki halka markörü Rlc1-domates ve septum membran markörü Bgs1-GFP'nin analizi, halkanın Bgs1-GFP alımından önce toplandığını ortaya koymaktadır. Halka daraldıkça, Bgs1-GFP ayrıca daralan halkaya bitişik giriş zarına da lokalize olur.

Son olarak, Rlc1-domates sinyali halka daralmasından sonra dağılırken, Bgs1-GFP zar bariyeri içinde kalan bir disk olarak görünür. Sitokinetik olayların etkinliği, proteinlerin halka boyunca dağılımı ile belirlenebilir. Burada, halka boyunca Cdc15-GFP dağılımı soldaki görüntüde düz, ancak sağdaki görüntüde düzensizdir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa iki ila üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, ideal olarak geç G2 veya erken M fazında altı ila sekiz iyi aralıklı hücre içeren ve agarda görünür safsızlıklar olmayan uygun bir alana sahip hücreleri seçmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, sitokinez sırasında protein lokalizasyonunu mekansal-zamansal olarak nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.