Canlı Görüntüleme Olgun Myofibers İn Vitro Farklılaşma içinde

Kas hücreleri en karmaşık ökaryotik hücreler arasındadır. Tüm gelişim aşamalarında genetik manipülasyon ve net görüntülemeye izin veren yüksek derecede olgun miyofiberlerin in vitro farklılaşması için bir protokol sunuyoruz.

Bu prosedürün genel amacı, izole edilmiş neonatal fare miyoblastları kullanılarak miyofiber farklılaşmasının dinamik süreçlerini incelemek için in vitro olgun miyofiberler üretmektir. Bu yöntem, tıp alanında miyofiber farklılaşması sırasında meydana gelen enine kesme triad oluşumu, sarkomer ve miyofibril montajı ve organel konumlandırması ile ilgili önemli bir soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin bir avantajı, anti ve miyofibril farklılaşma sürecinin, in vitro zaman atlamalı mikroskopi ile kolayca görüntülenebilmesidir.

Doğumdan altı ila sekiz gün sonra bir farenin cildini %70 etanol ile sterilize ederek başlayın. Daha sonra, sırt derisinde bir kesi yapın ve arka bacak kas sistemi tamamen açığa çıkana kadar cildi nazikçe arka bacaklara doğru çekin. Kaslara zarar vermeden yağ dokusunu çıkarın.

Ardından, dorsal arka bacak kaslarını çıkarmak için uzvu gergin tutun ve topuk tendonlarını ortaya çıkarın. Tendonlardan başlayarak, kemik boyunca nazikçe yukarı doğru kesmek için makası kullanın. Kasları hasat edilirken buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirmek.

Daha sonra kuadrisepsleri ince uçlu forseps ile sıkıştırın ve uyluk kemiğine veya diz eklemine zarar vermeden kasın etrafını kesin. Kuadrisepslerin diğer doku örnekleriyle bir araya getirilmesi. Steril bir laminer akış hücre kültürü başlığında, PBS'yi toplama kabından atın ve dokuları kıymak için steril kavisli makas kullanın.

Tüm numuneler işlendiğinde, doku parçalarını, çalkalama ile 37 santigrat derecede 90 dakikalık bir inkübasyon için beş mililitre sindirim karışımı içeren 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın. İnkübasyonun sonunda, altı mililitre diseksiyon ortamı ile sindirimi durdurun ve kalan dokuyu santrifüjleme ile peletleyin. Sindirimden sonra temiz bir hücre süspansiyonunun izolasyonu, protokolün başarısı için çok önemlidir.

Gerekirse, numunenin kontaminasyonunu önlemek için döküntülerin aspirasyonu veya ekstra santrifüjlemeler yapılabilir. Süpernatanı dikkatlice toplayın ve hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. İkinci peletin beş mililitre taze diseksiyon ortamında yeniden askıya alınması.

Daha sonra, bulamacı 40 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün ve tek hücreli süspansiyona 25 mililitre diseksiyon ortamı ekleyin. Fibroblast yapışmasına izin vermek için bir hücre kültürü inkübatöründe dört saat inkübe edin. Kuluçka süresinin son saatinin başında, fare başına iki adet 35 milimetrelik kabı 500 mikrolitre% 1 bazal membran matrisi ile soğuk IMDM ortamında bir saat boyunca oda sıcaklığında kaplayın.

Ön kaplamanın sonunda, süpernatanı toplayın ve yüzen hücreleri santrifüjleyin. Miyoblastları ve büyüme ortamını yeniden askıya alın ve hücreleri saydıktan sonra, hacmi kaplama için uygun hücre konsantrasyonuna ayarlayın. Daha sonra bazal membran matris kaplı plakaları DPBS ile yıkayın ve hücreleri hücre kültürü inkübatöründe inkübasyon için hemen plakalayın.

Üç gün sonra, hücreleri üreticinin talimatlarına göre uygun transfeksiyon reaktifleri ile tedavi edin ve hücreleri% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede beş saat boyunca ilgilenilen lipit kompleksleri ile inkübe edin. Ardından, farklılaşma ortamında iki yıkama yapın ve hücreleri gece boyunca inkübatöre geri koyun. Ertesi gün, her tabaktaki ortamı 200 mikrolitre %50 bazal membran matrisi ve buz gibi soğuk farklılaştırma ortamı ile değiştirin.

Hücre inkübatöründe 30 dakika daha bekledikten sonra, kültürleri agrin ve taze farklılaşma ortamı ile destekleyin, hücrelerin farklılaşmasını ve canlılığını tam olgunlaşmaya ulaşana kadar günlük olarak izleyin. İmmün boyama için, ilgilenilen deneysel zaman noktasında, hücreleri DPBS'de yıkayın ve ardından oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit içinde fiksasyon yapın. 10 dakika sonra hücreleri DPBS'de iki kez daha yıkayın, ardından oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 0.5 Triton X 100 ile geçirgenlik sağlayın.

İki DPBS yıkamasından sonra, spesifik olmayan bağlanmayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bloke edici solüsyon ile bloke edin. Daha sonra, hücreleri, gece boyunca dört santigrat derecede bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edin. Ertesi sabah, hücreleri oda sıcaklığında DPBS'de beş dakikalık üç yıkama ile durulayın ve kültürleri bir saat boyunca mililitre DAPI başına 0.2 mikrogram içinde uygun ikincil antikor ile inkübe edin.

Az önce gösterildiği gibi üç DPBS yıkamasından sonra, numuneleri 200 mikrolitre montaj ortamına monte edin ve hücreleri görüntüleyin. Proliferasyonun ikinci gününde, miyoblastlar plakaya yapışmış olmalı ve spontan miyotüp oluşumuna yol açan geniş proliferasyon ile tipik fusiform şekli göstermelidir. Miyotüpler hızla uzar ve zamanla artan olgun miyoliflerin sayısı arttıkça daha yüksek hücre kalınlığı, çizgiler ve periferik çekirdekler göstererek merkezi olarak hizalanmış birden fazla çekirdek gösterir.

Sekizinci diferansiyasyon gününde sabitlenen miyolifler, triadlarda kolokalize olması beklenen T tübüllerinin ve sarkoplazmik retikulumun bileşenlerinin görüntülenmesiyle doğrulandığı gibi enine triadlar sunar. Farklılaşmanın üçüncü gününden itibaren, hücreler, kalsiyum sensörü transfeksiyonundan sonra kalsiyum pikleri ile birlikte gözlenebilen spontan seğirme gösterir. Ayrıca, görüntülemeden sonra, kas kompleksi yapılarının organizasyonunu ve dinamiklerini daha iyi anlamak için bir 3D rekonstrüksiyon yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, hızlı olmayı hatırlamak ve bu hassas hücreleri bir inkübatörün dışında uzun süre tutmaktan kaçınmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, bu yenidoğan kas hücreleri için daha ileri aşağı akış analizi için elektron mikroskobu, süper çözünürlüklü mikroskopi, lazer mikro diseksiyon veya lazer oblasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, miyoblastların yenidoğan kaslarından nasıl izole edileceğini ve zaman atlamalı görüntüleme için en uygun koşullar altında yüksek derecede farklılaşmış miyofiberlerin in vitro üretimi için nasıl yetiştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.