Kalp Damar Cerrahisi sonra serum Örnekleri etkilenerek Sağlıklı Gönüllüler ve Bunların Göçmen Potansiyelden Endotel Ata Hücreleri İzolasyon

Bu hücre izolasyon prosedürünün ve migrasyon protokolünün genel amacı, endotelyal progenitör hücreleri ve bunların kardiyak cerrahi hastalarının serum örneklerine doğru göç potansiyellerini izole etmenin güvenilir bir yolunu göstermektir. Bu yöntem, iskemi ve yeniden perfüzyonla ilgili yaralanmalar nedeniyle kalp cerrahisi sonrası ihtiyaç duyulan endotel astarı ve kan damarlarının rejenerasyonunda kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, CD-34 pozitif hücrelerin ön izolasyonu da dahil olmak üzere progenitör hücreleri izole etmenin nispeten basit bir yoludur.

Ölümlere ek olarak, kalp cerrahisinin majör komplikasyonları çok sık görülmektedir. Kalp cerrahisi sırasında bağ riskinin ve koruyucu mekanizmaların belirlenmesi gerektiğinin altını çiziyor. Endotelyal progenitör hücreler, iskemik dokuların neovaskülarizasyonunda önemli rol oynarlar ve kardiyo-koruyucu özellikler sağladıkları bilinmektedir.

Deneye başlamak için, kanı bire bir kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile karıştırın. 50 mililitrelik bir tüpe 15 mililitre yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin. Ve seyreltilmiş kanı yavaşça yoğunluk gradyan çözeltisinin üzerine yerleştirin.

Ardından, numuneleri santrifüjleyin. Steril bir plastik pipet kullanarak, her tüpün buffy coat tabakasını dikkatlice toplayın ve yoğunluk gradyan çözeltisinden kaçınarak başka bir tüpe yerleştirin. Periferik kan mononükleer hücresini veya PBMC fraksiyonunu en az üç hacim PBS ile seyreltin ve çözeltiyi pipetleme ile karıştırın.

Karışımı oda sıcaklığında 200 kez G'de 15 dakika santrifüjleyin, daha sonra süpernatanı aspire edin ve hücre peletini beş mililitre endotel hücre büyüme ortamı olan MV-2'de yeniden süspanse edin. Hücreleri yeniden süspanse ettikten sonra, kullanılan buffy coat başına 100 mikrolitre insan CD-34 anti-koru ekleyin ve hücreleri döndürün. Kullanılan buffy coat başına 50 mikrolitre Dextran kaplı manyetik boncuk ekleyin ve hücreleri döndürün.

İnkübasyondan sonra, süspansiyonu her tüpe en fazla üç mililitre olacak şekilde faks tüplerine aktarın. Ardından, faks tüplerini mıknatıslara yerleştirin ve beş dakika bekleyin. Faks tüplerini mıknatıstan çekmeden süper natanı atın.

Ardından, mıknatısların dışında, her bir faks tüpündeki hücreleri üç mililitre MV-2 ortamı ile yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu önceden kaplanmış T-75 şişelerine aktarın. Her şişeye 17 mililitre MV-2 ortamı ekleyin.

Migrasyon tahlilini hazırlamak için, T-75 şişesindeki endotelyal progenitör hücrelerden veya EPC'lerden ortamı çıkarmak için bir pipet kullanın. Hücreleri beş mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın ve şişeyi dikkatlice sallayın. Ardından, PBS'yi çıkarın ve beş mililitre ticari hücre ayırma çözeltisi ekleyin.

Ardından, hücreler ışık mikroskobu altında ayrılana kadar bekleyin. Şişenin altına dikkatlice vurarak ayırma işlemini hızlandırın. Hücreler ayrıldığında, hızlı bir şekilde beş mililitre MV-2 tam ortam ekleyin ve hücre süspansiyonunu başka bir tüpe aktarın.

Hücreleri beş dakika boyunca 2.000 x G'de santrifüjleyin. Hücreleri peletledikten sonra, beş ila on mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Ve onları tekrar santrifüjleyin.

Hücreleri tekrar beş ila on mililitre PBS'de yeniden süspanse edin ve santrifüjleme ile takip edin. Hücre peletini MV-2 aç bırakılmış ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra, serum örneğini MV-2 açlık ortamında bir ila beş oranında seyreltin.

Alt hazneye 235 mikrolitre serum örneği ekleyerek migrasyon plakasını hazırlayın. Hücre çözeltisini eklemeden kısa bir süre önce eki ekleyin. Ardından, üst hazneye 75 mikrolitre hücre çözeltisi ekleyin.

EPC'lerin taşınmasına izin verin. Taşınmamış hücrelerin tümünü içeren üst bölmeyi çıkarın. Bir ila 1.000 oranında seyreltilmiş hoechst boyası dahil olmak üzere 75 mikrolitre yüzde 3.6 paraformaldehit çözeltisi ekleyin.

Tüm hücreleri bir ila iki dakika boyunca 2.000 x G'de aynı odak düzlemine sokmak için plakayı kısa bir süre santrifüjleyin. Serum oto-floresan artefaktlarını önlemek için, mikroskop altında 100x büyütme ile oyuk başına beş resim çekerek göç eden hücreleri ölçün. Son olarak, yarı otomatik yazılımı kullanarak taşınan hücreleri sayın.

EPC'lerin faks analizi, acLDL'nin alımını ve ayrıca izole edilmiş hücre popülasyonunun yüzeyindeki CD-31 ekspresyonunu doğrular. AcLDL ve CD-31'in analizinin izole edilmesi, her bir markörün homojen bir dağılımını ortaya koymaktadır. Elyso, miyokardiyal reperfüzyon hasarını takiben kalp cerrahisinin MIF, CXCL12, CXCL8 ve VEGF'nin dolaşımdaki serum seviyelerinin konsantrasyonları üzerindeki etkisini belirlemek için.

Serum örnekleri ameliyat öncesi ve intraoperatif olarak alındı. Serum MIF, CXCL12 ve CXCL8 seviyeleri, başlangıç değerlerine kıyasla önemli bir intraoperatif artış gösterdi. Buna karşılık, VEGF konsantrasyonları önemli bir değişiklik göstermedi.

Ameliyat öncesi ve sırasında alınan serum örnekleri kullanılarak yapılan bir ex vivo migrasyon testi, sağlıklı gönüllülerden izole edilen EPC'ler kullanılarak gerçekleştirildi ve intraoperatif olarak alınan numunelere doğru önemli ölçüde artmış bir migrasyon oranı ortaya çıkardı. Bu tekniği takiben, periferik kan mononükleer hücreleri, enflamatuar ile ilgili ek soruları yanıtlamak için kolayca izole edilebilir.