Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar.

Bu prosedürün genel amacı, floresan olarak işaretlenmiş tek hücreleri canlı bütün mount retinalardan izole etmektir. Bu yöntem, sinirbilimdeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Belirli bir nöronal sınıfın kaç alt tipi vardır ve her bir alt tip için genetik belirteçler nelerdir?

Bu tekniğin temel avantajı, retina dokusunun ayrışması ihtiyacını ortadan kaldırarak, hücrelerin izolasyondan önce daha sağlıklı bir ortamda hayatta kalmasına izin vermesidir. Bu tekniğin etkileri, floresan olarak etiketlenmiş herhangi bir hücre popülasyonuna kadar uzanır ve bu nedenle, sağlık ve hastalıkta hücresel çeşitliliği ve işlevi anlamak için diğer sistemlere uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü bu teknik, araştırmacının hücrenin canlılığından ödün vermeden bir hücreyi yama klempleme yeteneğine dayanır.

RNA izolasyon adımlarının öğrenilmesi zor olabileceğinden, bu yöntemin gelecekteki gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü küçük miktarda RNA, düzgün ve hızlı bir şekilde ele alınmazsa kolayca bozulabilir. Bu işleme başlamak için korneayı bir iğne ile delin ve kornea ve sklera sınırından kesin. Ardından, forseps kullanarak lensi çıkarın.

Sklerada nazikçe bir yırtık yapın ve retina ile skleranın birleştiği optik siniri kesin. Sklerayı retinadan çıkarmayı dikkatlice bitirin. Ardından, şeffaf vitreusu çıkarın.

Retinaları ikiye bölün ve kullanana kadar oda sıcaklığında oksijenli hücre dışı solüsyonda saklayın. Dokuyu kayıt odasına monte etmeye hazır olduğunuzda, bir petri kabında 500 mikrolitre oksijenli hücre dışı çözelti içinde seyreltilmiş enzim çözeltisine bir retina parçası aktarın ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Daha sonra, retinayı oksijenli hücre dışı solüsyonda yıkayın ve plastik bir transfer pipeti ile cam tabanlı bir kayıt odasına aktarın.

Bundan sonra, fotoreseptör tabakası aşağı bakacak şekilde dokuyu dikkatlice düzleştirmek için forseps kullanın. Bir pipet kullanarak fazla sıvıyı çıkarın ve naylon ağlı bir platin halka kullanarak dokuyu sabitleyin. Daha sonra, hazneyi oksijenli hücre dışı çözelti ile doldurun ve bir mikroskop aşamasına monte edin.

Dokuyu oksijenli hücre dışı çözelti ile dakikada iki ila dört mililitre oranında perfüze edin. Bu prosedüre hazırlanmak için, bir mikropipet çektirme kullanarak elektrofizyolojik kayıtlar için bazı cam mikropipetleri vurun. IR-DIC optiği kullanarak ganglion hücre tabakasını gözlemleyin.

Ardından, yaklaşık 480 nanometrede epifloresan kullanarak GFP artı ganglion hücrelerini tanımlayın. Ardından, DIC'de hücre içi çözelti ile doldurulmuş pipeti bulun. Hafif pozitif basınç uygulayın ve amplifikatör üzerindeki herhangi bir voltaj ofsetini sıfırlayın.

Ardından, cam mikropipeti bir GFP pozitif hücre üzerine indirin ve sızdırmazlık direncini izlemek için test voltajı komut adımlarını uygulayın. Negatif basınç, pipet ile hücre zarı arasında bir gigaohm conta oluşturmalıdır. Stabil bir sızdırmazlık oluşturduktan sonra, tüm hücre erişimi elde etmek için kısa negatif basınç darbeleri uygulayarak zarı yırtın.

Hücrenin dendritlerinin floresan izleyici ile dolması için bir ila iki dakika bekleyin. Bu adımda, on mililitrelik bir şırınga ile negatif basınç uygulayarak hücre sitoplazmik içeriğini dikkatlice pipete çıkarın. Bu arada, hücre gövdesinin boyutunun küçüldüğünü görselleştirerek DIC'deki ekstraksiyonu izleyin.

Sitoplazmik içeriği çıkardıktan sonra, pipeti dokudan dikkatlice kaldırın ve pipeti solüsyondan hızla çıkarın. Ardından, pipeti başlık tutucusundan hızlı bir şekilde çıkarın ve pipet ucunu DEPC ile işlem görmüş H2O ile kısa bir süre durulayın. Ardından, pipeti sıkı oturan boru aracılığıyla bir mililitrelik şırıngaya bağlayın.

Hücreleri hemen 0.2 mililitrelik PCR tüplerinde bir tane olmak üzere on mikrolitre lizis tamponuna atın. Tüpleri masa üstü mini santrifüjde 2000 kez g'de on saniye boyunca kısaca santrifüjleyin. Bunu takiben, numuneleri hemen kuru buz üzerinde beş dakika boyunca dondurun.

Dondurduktan sonra, en iyi sonucu elde etmek için eksi 80 santigrat derecede iki haftaya kadar saklayın. Bu prosedüre hazırlanmak için, ters çevrilmiş bir P20 veya P200 uç tutucunun üst kısmını 96 kuyulu manyetik standa bantlayarak bir manyetik ayırıcı cihaz kurun. Ardından, numune başına yaklaşık bir mililitre taze %70 etanol hazırlayın.

RNA manyetik boncuklarını 4 derece C depodan çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. RNA boncukları oda sıcaklığına geldiğinde, çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için onları 30 saniye boyunca girdaplayın. Bundan sonra, hücreleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca çözdürün.

Ardından, her numuneye beş mikrolitre Rnaz içermeyen H2O ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, her tüpe 22 mikrolitre RNA boncuk ekleyin ve iyice karıştırın. RNA'nın manyetik boncuklarla etkileşime girmesine ve bağlanmasına izin vermek için numuneleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Bunu takiben, tüpleri sekiz dakika boyunca manyetik bir ayırıcı cihaza yerleştirin. Devam etmeden önce, süpernatantın açık olduğundan emin olun. Boncukları bir paletten gözlemleyin ve pipetleme sırasında tüpün yanından çıkarmadığınızdan emin olun.

Süpernatanı numunelerden çıkarın ve 150 mikrolitre% 70 etanol ekleyin. Ardından etanolü çıkarın ve yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Numunelerin altı dakika kurumasına izin verin.

Tüpün dibinde daha fazla etanol toplanıp toplanmadığını görmek için aralıklı olarak kontrol edin ve buna göre çıkarın. Boncukları uygun şekilde kurutmanın çok önemli olduğunu unutmayın. Boncuklar yeterince kuru değilse, etanol eluent ile birlikte taşınabilir ve toplam verimi düşürürken, aşırı kurutulmuş boncuklar RNA kaybına neden olabilir.

Numuneler kururken, 19 mikrolitre lizis tamponu iki ve bir mikrolitre Rnaz inhibitörünü birleştirerek 10x reaksiyon tamponu hazırlayın. Kısa bir süre döndürün ve buz üzerinde tutun. Numuneler kuruduğunda ve boncuk peletleri artık parlak görünmediğinde, tüpleri manyetik ayırıcıdan çıkarın ve numuneleri yeniden sulandırmak için 9,5 mikrolitre Rnaz içermeyen H2O ekleyin.

Ardından, numuneleri buzun üzerine yerleştirin ve her numuneye bir mikrolitre 10x reaksiyon tamponu ekleyin. Bu görüntü, tüm retina hazırlığında IR-DIC kullanılarak görselleştirilen retinanın ganglion hücre tabakasını göstermektedir. Aynı preparat, GFP pozitif ganglion hücrelerini tanımlamak için yaklaşık 480 nanometrede epifloresanda görselleştirildi.

Bu görüntü, yama kelepçesi kaydı için hedeflenen ve bir floresan izleyici ile doldurulmuş bir GFP pozitif hücreyi göstermektedir. İç pleksiform tabakanın açık ve kapalı sublaminasında görüntülenen ipRGC dendritlerinin konfokal görüntüsü, bu hücre tiplerinin sınıflandırılmasına izin verir Bu biyoanalizör çıktısı, ters transkripsiyon, amplifikasyon ve saflaştırma geçirmiş kütüphanelerin örneklerini gösterir. Bir ila üç şerit ideal DNA yaymalarını gösterirken, dördüncü şerit kötü işlenmiş bir numuneyi temsil eder.

Kontrol şeridi, 35 bp ve 10380 bp işaret boyutlarında iki temiz tepe içermelidir. İşte 2 kb civarında yüksek yoğunluklu başarıyla hazırlanmış bir kütüphanenin detaylı bir izi. Bu iz aynı zamanda başarılı bir preparasyonu gösterir, ancak smear 500 bp civarında merkezlenmiştir.

Bu görüntü, numunelerin etiketlenmesini, amplifikasyonunu ve saflaştırılmasını takiben biyoanalizör çıkışını göstermektedir. Başarılı bir şekilde etiketlenmiş bir numunenin ayrıntılı izi, birinci şeritteki numuneye karşılık gelen burada görülebilir. Eksik etiketleme, burada görülene benzer bir ize neden olacak ve taze bir seyreltme ile yeniden etiketlemeyi garanti edecektir.

Bu videoyu izledikten sonra, sağlam retinadaki floresan etiketli hücre tiplerinden RNA'yı nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, RNA'nın bozulmaya karşı çok hassas olduğunu ve sağlıklı retina hücrelerine sahip olmanın anahtar olduğunu hatırlamak önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, tanımlanan genlerin belirli bir hücresel alt tipe özgü olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için qPCR, NC2 hibridizasyonu, veya immünohistokimya gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların önünü açmış ve çeşitli beyin bölgelerindeki nöronların heterojenliğini anlamaya çalışmıştır. Bu heterojenliğin anlaşılması, moleküler olarak tanımlanmış popülasyonlarda hücresel işlev ve bağlantı ile ilgili gelecekteki çalışmalara izin verecektir.