Fare Kan Gemilerinin Yüz Yüzey Hazırlığı

Fare karotid arteri ve aortanın yüz öncesi hazırlıkları yapmak için bir prosedür anlatılmıştır. Bu preparatlar, immünofloresan olarak spesifik antikorlarla boyandığında, konfokal mikroskopi ile proteinlerin lokalizasyonu ve tüm vasküler duvar içindeki hücre tiplerinin tanımlanmasını sağlar.

Bu prosedürün genel amacı, sol karotis arter ligasyonu sonrası fare aortunu ve karotis arterini en yüz immün boyaması için hazırlamaktır. Bu yöntem, immünoboyama yöntemlerinde antral hücrelerin ve diğer vasküler hücrelerin organizasyonunu, her bir protein ekspresyonunu ve olası durumunu incelememizi sağlar. Yüz preparatları, çeşitli normal ve olası hücre parametrelerinin ifadesindeki bölgesel farklılığın değerlendirilmesi için kan damarları boyunca geniş alanların analizine izin verir.

Prosedürü gösteren, grubumuzdaki bir mikro cerrah olan Dr.Quaico olacaktır. Anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyonda bir cerrahi tahtaya yerleştirerek başlayın. Ayak parmağını kıstırmaya yanıt verilmediğini onayladıktan sonra, ön pençeleri gergin pozisyonda tahtaya bantlayın ve her iki arka bacağı boynun sol tarafına maruz bırakacak şekilde farenin sağ tarafına bantlayın.

Servikal bölgenin etrafındaki tüyleri alın ve maruz kalan cildi dezenfekte edin. Fareyi, cerrahi bölge üzerinde bir delik bulunan sterilize edilmiş bir cerrahi örtü ile örtün ve hayvanın gözlerine merhem sürün. Fareyi diseksiyon mikroskobu altında hareket ettirin ve servikal alanın etrafında ventral orta hat insizyonu yapın.

Sol iç karotis artere ve sol dış karotis artere çatallanan sol ortak karotis arteri ortaya çıkarmak için kan damarlarını kaplayan tükürük bezlerini hayvanın sol tarafına yeniden konumlandırın. Sol internal karotis arterin etrafındaki ve altındaki bağ dokusunu nazikçe çıkarın ve bir forseps kullanarak 2,5 santimetre uzunluğunda önceden kesilmiş altı O ipek sütürü arterin altından geçirin, ikinci bir forseps kullanarak dikişi uzunluğunun yaklaşık üçte biri kadar çekin. Sol iç karotis arteri bağlayın.

Daha sonra az önce gösterildiği gibi sol dış karotid arterin etrafındaki bağ dokusunu çıkarın ve sol superior tiroid arterine proksimalde bir ligasyon yapın. Oksipital arter dışındaki tüm arterler bağlandığında, tükürük bezlerini orijinal konumlarına geri getirin ve cerrahi alanı iki ila üç damla salin ile nemlendirin. Daha sonra cildi kapatmak için altı O kaplı vicryl sütür kullanın ve fareyi tamamen yaslanana kadar izleme ile önceden ısıtılmış kafese yerleştirin.

Deneyin sonunda, fareyi bir diseksiyon tahtası üzerinde sırtüstü pozisyonda sabitleyin ve karın boşluğunu orta hat insizyonu ile ortaya çıkarmak için iris makası kullanın. Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburgaları sternuma yanal olarak kesin. Daha sonra femoral arteri çentikleyin ve dolaşım sistemini heparin ile desteklenmiş salin solüsyonu ile doldurmak için sol ventrikülün tepesine yerleştirilmiş bir yerçekimi bolluğuna bağlı 26 gauge bir iğne yerleştirin.

Kesikten akan tuzlu su berraklaşana kadar bolluğa devam edin. Ardından profüzyon sistemini PBS'de salinden %4 paraformaldehite geçirin. Beş dakika sonra, fareyi diseksiyon mikroskobunun altına getirin ve aortu ve sol ve sağ karotis arterleri çıkarmak için künt uçlu makas ve forseps kullanın.

Daha sonra, dokuları PBS'nin bir Petri kabına aktarın ve yağ ve bağ dokularını dikkatlice çıkarın, ardından endotelyumu açığa çıkarmak için aort ve karotis arterlerin ayrılması ve uzunlamasına bölünmesi devam eder. Yüz kan damarı hazırlıkları yaparken hatırlanması gereken en önemli şey, endotel hücrelerinin kaba kullanım nedeniyle kolayca zarar görmesidir. Kapları hiçbir zaman, özellikle hasat ve temizleme aşamalarında germeyin.

Daha sonra her bir kabı, oyuk başına 0,5 mililitre geçirgenleştirici çözelti içeren 12 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Kan damarlarını oda sıcaklığında sallayarak 10 dakika boyunca geçirgen hale getirin, ardından PBS'de kısa bir yıkama yapın. TTBS'de planlanan ikincil antikorlarla aynı türden% 10 normal serumda 30 dakikalık bir inkübasyon ile oda sıcaklığında sallanarak herhangi bir spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.

Daha sonra numuneleri, TTBS'de% 10 normal serum ile seyreltilmiş ve gece boyunca dört santigrat derecede sallanarak ilgili birincil antikorlarla etiketleyin. Ertesi sabah, kan damarlarını oda sıcaklığında sallanarak TTBS'de 10 dakikalık üç yıkama ile durulayın, ardından TTBS ve% 10 normal serum ve dappy içinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorlarda inkübasyon yapın. Numuneleri külbütöre geri koyun ve ışıktan korumak için örtün.

Oda sıcaklığında bir saat sonra sallanarak numuneleri gösterildiği gibi taze TTBS'de üç kez yıkayın, ardından PBS'de kısa bir durulama yapın ve kap başına bir damla solma önleyici reaktifi 22 x 50 milimetrelik ayrı ayrı kapak camlarına yerleştirin. Mikroskop altında, endotel aşağı bakacak şekilde her bir reaktif damlasına bir kap yerleştirin ve damarları numune başına 22 x 75 milimetre kayar cam ile kaplayın. Slaytları temiz bir laboratuvar mendili üzerine yerleştirin ve kapları düzleştirmek için üzerlerini iki parça laboratuvar mendili ve 3,5 kilogram ağırlıkla örtün.

En fazla beş dakika sonra, ağırlığı çıkarın ve fazla solüsyonu kapak fişlerinin etrafından silin. Daha sonra kapak fişlerinin dört köşesine oje sürün ve slaytları kapak slipi yukarı bakacak şekilde bir slayt kutusuna yerleştirin. Ertesi sabah, kapak fişlerini tamamen kapatmak için daha fazla oje kullanın ve oje kuruduktan hemen sonra damarları görüntüleyin.

Burada, anti VE kaderin ve antivasküler hücre adezyon molekülü bir antikorla boyanmış endotelyal çift boyanmış ve interkostal arterin açıklığına yakın çekilmiş bir fare aortunun tek bir optik kesitini gösteren tipik bir yüz immünofloresan görüntüsü gösterilmektedir. Endotel hücrelerinin yapışma kavşağındaki yeşil doğrusal anahat boyamasına ve bozulmuş kan akışının meydana geldiği bilinen interkostal arterin açılışında güçlü anti vasküler hücre adezyon molekülü olan bir boyamaya dikkat edin. Bu görüntülerde, ameliyattan bir gün sonra kısmen bağlanmış bir sol karotis ve kontrol bağsız bir sağ arterin en yüz boyaması ve bağlanmış damarda bir lekelenme ile anti vasküler hücre adezyon molekülünün arttığı görülmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, kısmi sol karotis arter ligasyonunun nasıl yapılacağını ve fare kan damarlarında yüz hazırlıklarının nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bunu optiğinizle diğer küçük hayvanlara götürün. Yüz preparatlarının kullanımı artık immünofloresan boyama ile sınırlıdır, ancak oriole boyamadan sonra tüm bu bölgelerin incelenmesi veya ex vivo sayaç deneyleri gibi diğer yöntemlerle de kullanılabilir.