Yağ vücut Organ kültür sistemi içinde Aedes Aegypti, bir vektör Zika virüs

Merhaba, benim adım Immo Hansen, New Mexico Eyalet Üniversitesi'ndeki Moleküler Vektör Fizyolojisi laboratuvarından. Bugün göstereceğimiz sivrisinek yağı vücut kültürü sistemi, sivrisineklerin karın vücut duvarlarına bağlı canlı yağ vücut dokusunun fizyolojisini ve metabolizmasını incelemek için laboratuvarımızda kullandığımız bir in vitro organ kültürü sistemidir. Böcek yağ gövdesi birçok metabolik sürecin gerçekleştiği bir organdır.

İşlevleri, omurgalılardaki karaciğer ve yağ dokularının işlevlerini yansıtır. Bu sistemi, sarı humma sivrisineği Aedis aegypti'de yumurta sarısı protein üretiminin düzenlenmesini ve besin alım mekanizmalarını incelemek için kullandık. Aedi aegypti, dang humması, chikungunya ve zika gibi arbovirüsün temel bir vektörüdür.

Sivrisinek yağ gövdesi, sivrisineklerde yumurta sarısı proteinlerinin tek kaynağıdır. Bu video protokolü, bir in vitro sivrisinek yağ vücut kültürü sistemini gösterir ve sistemin çeşitli deneysel uygulamalarını gösterir. Göstereceğimiz protokol birden fazla parça halinde oluşturulmuştur.

İlk olarak, yağ vücut kültürü sistemi için gerekli solüsyonları ve reaktifleri hazırlayacağız. İkincisi, yağ cisimlerini izole etmek için sivrisinek diseksiyonları yapacağız. Sonra, son olarak, yumurta sarısı protein sentezini aktive etmek için izole edilmiş yağ kütlelerini amino asitle zenginleştirilmiş bir ortama aktaracağız.

Yağ vücut kültürünü takiben gerçekleştirilebilecek birkaç alt uygulama vardır. Bugün yağ vücut kültürünü ve ardından yeni nesil dizileme yapacağız. Uyarılmamış bir örnek ile amino asitler ve ekdison ile uyarılmış bir örnek olmak üzere iki örneği karşılaştıracağız.

İhtiyaç duyulacak ek malzeme ve ekipmanlar arasında sivrisinek toplama şişesi olan aspiratör, CO2 gazı şişesine bağlanmış CO2 sinekliği, sinekliği temizlemek için etanol, ışık kaynaklı stereo mikroskop, diseksiyon mikro makası, ince uçlu cımbız ve 96 adet kuyulu plaka bulunmaktadır. Yağ vücut kültürüne hazırlanmak için, amino stok çözeltisi, Aedes fizyolojik tuzlu su stok çözeltisi ve kalsiyum stok çözeltisi olmak üzere üç stok çözeltisi ve reaktif hazırlanmalıdır. Aedes fizyolojik tuzlu su stoğu çözeltisi ve kalsiyum stoğu çözeltisi, yağ vücut kültürü ortamını oluşturmak için birleştirilir.

Bu deney için kullanılan sivrisinekler ortaya çıktıktan sonra en az üç günlük olmalıdır. Pille çalışan bir aspiratör kullanarak, sivrisinekleri bir toplama şişesine toplayın. Sivrisinekleri uyuşturmak için numunenizle birlikte toplama şişesini bir CO2 pedine yerleştirin.

Alternatif olarak, sivrisinekleri uyuşturmak için buz kullanılabilir. Diseksiyonlara başlamadan önce tüm erkekleri atın. İlk olarak, görünürlüğü sağlamak için bir test sivrisineği kullanarak diseksiyon mikroskobunu odaklayın.

Mikroskobu odakladıktan sonra, mikroskobun üzerine içbükey bir slayt yerleştirin ve ortasına iki damla APS yerleştirin. APS, sivrisinekleri yüksekte tutmaya ve çeşitli sivrisinek organlarını toplamaya yardımcı olur. Forseps ile sivrisinek seçin, sivrisinekleri bacaklarından toplayın.

Bacakları çıkarın. Sivrisineği sol elinizle göğüs kafesinden tutarken, sivrisinekleri karnın son iki veya üç segmentinden kavramak için diğer forsepsleri kullanın ve çıkarmak için hafifçe çekin. Bu eylem yumurtalıkları, malpighian tübüllerini, arka bağırsağı, orta bağırsağı ve mahsulü çıkarmalıdır.

Organlar çıkarıldıktan sonra, yağ gövdesinin diseksiyonunu bitirmek için yaylı makası kullanın. Karnın son iki ila üç segmentinin çıkarılmasıyla oluşturulan deliğe bir bıçak sokun ve karnı göğüs kafesinin altındaki segmente ulaşana kadar uzunlamasına kesin. Kesi sonrası karın dışa doğru genişlemelidir.

Başka bir kesi, ilk kesinizin sona erdiği karnın üst kısmı boyunca yanal olarak yapılır. Kesilerden sonra, karın açılır ve kütikül tarafı yukarı bakacak ve yağ cisimleri APS içinde dinlenecek şekilde yüzer. Yağ cisimleri APS solüsyonu üzerinde en az yarım saat dengelendikten sonra, daha sonra yağ vücut kültürü ortamına aktarılabilirler.

Yağ cisimciklerini yumurta sarısı proteini gen ekspresyonuna başlamaları için uyarmak için, onları yüksek düzeyde serbest amino asit ve böcek steroid hormonu 20-hidroksiekdison içeren bir ortama aktarıyoruz. Aktarıldıktan sonra, yağ cisimleri ortamda altı saat inkübe edilir. Kuluçka döneminden sonra, yağ cisimleri istenen analizler için uygun bir tampon ile bir eppendorf tüpüne aktarılır.

Deneysel hedefe bağlı olarak, yağ cisimleri qPCR, Western blots, proteomik, metabolomik veya RNA-seq gibi birkaç sonraki protokolde kullanılabilir. Örnek olarak, bir yağ vücut kültürü deneyi gerçekleştirdik ve izole edilmiş yağ cisimlerini, doğal olarak oluşan 20 amino asidin tümünün ve böcek steroid hormonu 20-hidroksiekdisonun dengeli bir karışımını içeren bir çözelti üzerinde altı saat boyunca inkübe ederek uyardık. Bu şekil, deneyimizin RNA-seq analizinin sonuçlarını göstermektedir.

Isı haritası, iki farklı tedavi altında kültürlenmiş yağ cisimlerinde eksprese edilen 1256 genin gen ekspresyon seviyelerini gösterir. Bu genlerin tümü, iki tedavi arasındaki ekspresyon seviyelerini önemli ölçüde değiştirmiştir. Bu tablo, kültürlenmiş yağ cisimciklerinin amino asitler ve 20-hidroksiekdison ile aktivasyonundan sonra en fazla regüle edilen on geni göstermektedir.

Beklendiği gibi, bu genlerin çoğu yumurta sarısı protein genleridir. Sivrisinek yağ vücut kültürüne gösterdiğiniz ilgi için teşekkür ederiz.