Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Bu prosedürün genel amacı, sağlıklı ve saf serebellar granül nöron popülasyonları üretmek, bunları genetik olarak manipüle etmek ve in vitro primer kültürde farklı nöronal hasar mekanizmalarını modellemektir. Bu yöntem, nöronal hasar alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokolü, akut beyin hasarı ve nörodejeneratif hastalıklar sonrası meydana gelen nöral hasarların altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için kullanıyoruz.

Bu protokolün temel avantajı, kültür sistemini kullanarak eksitotoksisite, oksidatif stres, DNA hasarı ve gelişimsel olaylar gibi farklı hücre ölümü mekanizmalarını modelleyebilmemizdir. Bu yöntem nöronal yaralanmalar hakkında bilgiler sağlayabildiği gibi, büyüme faktörlerine ve yan olaylara yanıt olarak nöronal aktiviteyi ve morfogenezi incelemek için sıçan serebellar nöronlarıyla da kullanılabilir. Altı ila yedi günlük bir farenin beynini çıkarmak için, başı kavramak amacıyla bir pens kullanın ve mikro-diseksiyon makasıyla deriyi başa doğru anterior yönde kesin.

Kafatası açığa çıkana kadar deriyi geriye doğru itin. Ardından, makasın ucuyla kafatasını delin ve anterior ve lateral yönlerde kesin. Serebelluma zarar vermemeye dikkat ederek meninkslerin tanımlanmasını ve çıkarılmasını kolaylaştırın, daha sonra beyni açığa çıkarmak için pens yardımıyla kafatasını soyun.

Bir pens veya spatula yardımıyla, beyni nazikçe soğuk diseksiyon solüsyonuna çıkarın. Serebellumu izole etmek için beyni, magnezyum sülfat ile desteklenmiş diseksiyon solüsyonuna yerleştirin; solüsyonu ve beyni buz üzerinde tutun. Diseksiyon mikroskobu altında, ince pens kullanarak meningesleri temizleyin, ardından magnezyum sülfat destekli diseksiyon solüsyonu içerisinde serebellumu beyinden ayırarak çıkarın.

Bu işlem, geri kalan meningeslerin soyulmasına yardımcı olur ve serebellar kıvrımların temizlenmesi için katmanların arasına girilmesine olanak tanır. Nöronal kültürde meningeslerin bulunması, hücrelerin sağlıksız olmasına ve nihayetinde hücre ölümüne yol açar. Bu nedenle, kültüre geçmeden önce meningeslerin tamamen uzaklaştırıldığından emin olmak önemlidir.

Bundan sonra, serebellumu ventral tarafına çevirin ve koroid pleksusun uzaklaştırıldığından emin olun. Ardından, serebellumlari bir mililitre magnezyum sülfat takviyeli diseksiyon solüsyonu içeren 35 milimetrelik bir kaba alın. Dokuları küçük parçalara bölün ve 30 mililitre magnezyum sülfat tamponlu diseksiyon solüsyonu içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Bu adımda, parçalanmış serebral dokuyu içeren 15 milliliter tüpü, 644 ×g'de ve 4 °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatantı uzaklaştırın ve 10 milliliters trypsin diseksiyon solüsyonu ekleyin. Daha sonra tablayı 37 °C'de 15 dakika boyunca yüksek hızda sallayın.

Tüpe iki mililitre tripsin inhibitörü çözeltisi bir ekleyin ve iki dakika boyunca hafifçe sallayın. Ardından, tübü 644 ×g'de ve dört °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Beş dakika sonra süpernatantı uzaklaştırın, iki mililitre tripsin inhibitörü çözeltisi iki ekleyin ve ardından örneği 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Ardından, çözelti bulanık hale gelene kadar dokuyu 15 mililitrelik tüp içerisinde tritüre edin. Beş dakika boyunca çökelmesini bekleyin. Daha sonra berrak süpernatantı uzaklaştırın ve kalsiyum klorür takviyeli diseksiyon çözeltisi içeren bir mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Peleti içeren tüpün altına iki mililitre daha tripsin inhibitörü çözeltisi iki ekleyin. Tekrar tritürasyon yapın ve beş dakika boyunca çökmesini bekleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve bir önceki adımdan gelen süpernatantın bulunduğu tüpe ekleyin.

Dokunun çoğu mekanik olarak ayrışana kadar bu işlemi tekrarlayın. Her 1 mililitre süpernatan için süpernatan toplama kabına 0,3 mililitre kalsiyum klorür katkılı diseksiyon solüsyonu ekleyin. Tüpün içeriğini karıştırın ve ardından oda sıcaklığında 644 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Bunun ardından, süpernatanı uzaklaştırın. Pellete 10 mililitre taze besiyeri ekleyin ve karıştırın. Ardından canlı hücreleri sayın ve bunları 1,5 x 10⁶ hücre/ml konsantrasyona seyreltin.

Hücreleri önceden hazırlanmış poli D-lizin plaklarına ekleyin. Dört kuyucuklu plaklar için, kuyucuk başına 7,5 × 10⁵ hücre gelecek şekilde örnekten 0,5 ml ekleyin. 35 mm'lik kaplar için, plak başına 6 × 10⁶ hücre gelecek şekilde örnekten 4 ml ekleyin.

Lamel kullanımı için, kuyuk başına 7.5 × 10⁵ hücre olacak şekilde 0,5 mililitre ekleme yapın. 24 saat sonra, glial kontaminasyonu azaltmak için plakalara AraC ekleyin. Hücrelerin yedi ila sekiz gün boyunca korunması gerekiyorsa, bu işlemi üçüncü günde tekrarlayın ve kültürleri 37 °C'de %5 CO2 inkübatöründe muhafaza edin.

Beş günden daha uzun süre tutulan kültürler için, beşinci günden başlayarak her iki günde bir kültüre glukoz eklemesi yapın. NMDA ile nöronal eksitotoksisiteyi indüklemek için, in vitro ortamdaki yedinci günün ardından, serebellar granül nöronları bir saat boyunca 100 micromolar NMDA ve 10 micromolar glisin ile işleme tabi tutun. Ardından, besiyerini, herhangi bir işlem uygulanmamış paralel kültürlerden elde edilen kondisyonlu besiyeri ile değiştirin.

Bu konsantrasyon, işlemden 24 saat sonra %50 hücre ölümüne yol açar. ROS kaynaklı hücre ölümü için nöronları 75 ila 100 micromolar hidrojen peroksit ile beş dakika boyunca işleme tabi tutun. Beş dakika sonra, bunu paralel kültürlerden elde edilen kondisyonlu medyuma değiştirin.

Hidrojen peroksitin instabilitesi nedeniyle, konsantrasyon 24 saat sonra %50 ile %70 arasında hücre ölümü oluşturacak bir seviyeye optimize edilmelidir. Bu konsantrasyon genellikle 75 ve 100 micromolar arasındadır. DNA hasarı yoluyla hücre ölümünü indüklemek için, 24 saat içinde %50'den fazla hücre ölümü oluşturmak amacıyla serebellar granül nöronları 10 micromolar kamptotesin ile işleme tabi tutun.

Serebellar granül nöronlarda düşük potasyumla indüklenen nöronal apoptoz için, in vitro yedinci günün ardından 25 milimolar potasyum içeren besiyeri, beş milimolar potasyumlu düşük potasyum besiyeri ile değiştirilir. Nöronlar, ekim sırasında 3 MOI değerinde RFP için lentivirüs ile transdukse edilmiştir. İn vitro yedinci günde tespit ve boyama işlemleri gerçekleştirilmiştir.

Lentivirüslerle tamamen transduce edilmiş sağlıklı nöronları göstermek için RFP sinyali, MAP2 ve Hoechst'in ko-lokalizasyonu sunulmuştur. Burada gösterilen görüntüler, toksisiteyi ölçmek amacıyla farklı adenovirüs MOI değerleri ile enfekte edilen nöronların canlı-ölü analizlerini temsil etmektedir. LacZ ekspresyonu yapan adenovirüsle 25 ile 50 arasındaki bir MOI değerinde enfekte edilen serebellar granül nöronlar, minimum toksisiteyi korurken maksimal verimlilik sağlar.

Bu MOI ile enfeksiyon yapıldığında, kontrol grubuna kıyasla hücre sağkalımında %1'den daha az fark görülür. Bu şekiller, kontrol serebellar granül nöronlarının ve hücre ölümünü indüklemek için NMDA ile işlem görmüş serebellar granül nöronlarının Hoechst boyamasını göstermektedir. NMDA uygulamasıyla piknotik çekirdeklerin oluştuğuna dikkat ediniz.

Bu durum hücre ölümünün bir göstergesidir ve 100 micromolar NMDA ve 10 micromolar glisin ile işlemden 24 saat sonra kültürün yaklaşık %50'sinde görülebilir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde altı fare örneği ile iki buçuk saatte tamamlanabilir. Bu teknik uygulanırken, kültür kontaminasyonu riskini en aza indirmek için aseptik teknik kullanılması ve gerektiğinde steril cerrahi aletlerin kullanılması önemlidir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların primer fare nöronlarında nöronal gelişimi ve nöronal hasarı incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, serebellar granüler nöronları kültüre edebilmeli, virüsler kullanarak bunları genetik olarak manipüle edebilmeli ve çeşitli nöral hasar mekanizmalarını indükleyebilmelisiniz. Bu prosedürün ardından, ilgi duyulan bir genin eksitotoksisite, oksidatif stres veya DNA hasarına yanıt olarak hücre sağkalımını artırıp artırmadığı gibi soruları yanıtlamak için immünofloresans veya hücre canlılığı analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.