Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Bu prosedürün genel amacı, serebellar granül nöronlarının sağlıklı saf popülasyonlarını üretmek ve bunları genetik olarak manipüle etmek ve in vitro primer kültürde farklı nöronal hasar mekanizmalarını modellemektir. Bu yöntem, nöronal yaralanma alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu protokolü, akut beyin hasarı ve nöro-generatif hastalıkları takiben ortaya çıkan nöral yaralanmaların altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanıyoruz.

Bu protokolün temel avantajı, kültür sistemini kullanarak eksitotoksisite, oksidatif stres, DNA hasarı ve gelişimsel olay gibi farklı hücre ölümü mekanizmalarını modelleyebilmemizdir. Bu yöntem nöronal hasar hakkında bilgi sağlayabilse de, büyüme faktörlerine ve yan olaylara yanıt olarak nöronal aktiviteyi ve morfogenezi incelemek için sıçanların serebellar nöronları ile de kullanılabilir. Altı ila yedi günlük bir farenin beynini çıkarmak için, bir kafayı kavramak için bir çift forseps kullanın ve mikro diseksiyon makası ile cildi başa doğru öne doğru kesin.

Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi geriye doğru itin. Daha sonra, makasın ucuyla kafatasına nüfuz edin ve öne ve yanlara doğru kesin. Beyinciğe zarar vermemeye ve meninkslerin tanımlanmasını ve çıkarılmasını kolaylaştırmaya özen göstererek, beyni açığa çıkaran kafatasını soymak için forseps kullanın.

Bir çift forseps veya spatula ile beyni nazikçe soğuk diseksiyon solüsyonuna sokun. Beyinciği izole etmek için beyni magnezyum sülfat ile takviye edilmiş diseksiyon solüsyonuna yerleştirin ve solüsyonu ve beyni buz üzerinde tutun. Diseksiyon mikroskobu altında, ince forseps kullanarak meninksleri çıkarın, ardından magnezyum sülfat takviyeli diseksiyon solüsyonunda beyincikleri beyinden çıkarın.

Bu, kalan meninkslerin soyulmasına yardımcı olur ve serebellar kıvrımları temizlemek için katmanların arasına girmesine izin verir. Meninkslerin varlığı, sağlıksız hücrelere ve nihayetinde hücre ölümüne neden olan nöronal kültürdür. Bu nedenle, kültüre devam etmeden önce meninkslerin tamamen çıkarılmasını sağlamak önemlidir.

Bundan sonra, beyinciği ventral tarafına çevirin ve koroid pleksusun çıkarılmasını sağlayın. Daha sonra, serebellayı bir mililitre magnezyum sülfat takviyeli diseksiyon çözeltisi içeren 35 milimetrelik bir tabağa çekin. Dokuları küçük parçalar halinde doğrayın ve 30 mililitre magnezyum sülfat tamponlu diseksiyon solüsyonu içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Bu adımda, doğranmış serebral dokuyu içeren 15 mililitrelik tüpü 644 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Bundan sonra süpernatanı çıkarın ve 10 mililitre tripsin diseksiyon çözeltisi ekleyin. Daha sonra masayı 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca yüksek hızda sallayın.

Tüpe iki mililitre tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin ve iki dakika boyunca hafifçe sallayın. Daha sonra, tüpü 644 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Beş dakika sonra, süpernatanı çıkarın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce iki mililitre tripsin inhibitörü çözeltisi iki ekleyin.

Daha sonra, çözelti bulanık hale gelene kadar dokuyu 15 mililitrelik tüpte ezin. Beş dakika oturmasına izin verin. Daha sonra berrak süpernatanı çıkarın ve bir mililitre kalsiyum klorür takviyeli diseksiyon çözeltisi içeren yeni bir tüpe aktarın.

Peleti içeren tüpün dibine iki mililitre tripsin inhibitörü çözeltisi daha ekleyin. Tekrar ezin ve beş dakika oturmasına izin verin. Süpernatanı çıkarın ve önceki adımdan süpernatan içeren tüpe ekleyin.

Dokunun çoğu mekanik olarak ayrışana kadar bu işlemi tekrarlayın. Her mililitre süpernatan için süpernatan koleksiyonuna 0.3 mililitre kalsiyum klorür takviyeli diseksiyon solüsyonu ekleyin. Tüpün içeriğini karıştırın ve daha sonra oda sıcaklığında 644 kez G'de beş dakika santrifüjleyin.

Bunu takiben, süpernatanı çıkarın. Peletlere 10 mililitre taze ortam ekleyin ve karıştırın. Daha sonra canlı hücreleri sayın ve bunları mililitrede 1.5 kez 10 ila altı hücre konsantrasyonuna seyreltin.

Hücreleri önceden hazırlanmış poli D-lizin plakaları üzerine yerleştirin. Dört oyuklu plaka için, numunenin 0,5 milimiterlik plakası, oyuk başına beşinci hücreye 7,5 kez 10 verir. 35 milimetrelik tabaklar için, numunenin dört mililitresini plakalayın ve plaka başına altı kez 10 ila altıncı hücre verin.

Kapak kaymaları için, plaka 0.5 mililitre, oyuk başına beşinci hücrelere 7.5 kez 10 verir. 24 saat sonra, glial kontaminasyonu azaltmak için plakalara AraC ekleyin. Hücreler yedi ila sekiz gün boyunca korunacaksa, bu işlemi üçüncü günde tekrarlayın ve kültürleri 37 santigrat derecede% 5 CO2 inkübatörde tutun.

Beş günden daha uzun süre muhafaza edilen kültürler için, beşinci günden başlayarak kültürü her iki günde bir glikozla besleyin. NMDA ile nöronal eksitotoksisiteyi indüklemek için, in vitro yedi gün sonra, serebellar granül nöronlarını bir saat boyunca 100 mikromolar NMDA ve 10 mikromolar glisin ile tedavi edin. Daha sonra, besiyerini hiçbir işlem görmeden paralel kültürlerden şartlandırılmış besiyeri ile değiştirin.

Bu konsantrasyon, tedaviden 24 saat sonra% 50 hücre ölümü ile sonuçlanır. ROS kaynaklı hücre ölümü için, nöronları beş dakika boyunca 75 ila 100 mikromolar arasında hidrojen peroksit ile tedavi edin. Beş dakika sonra, paralel kültürlerden koşullandırılmış ortama geçirin.

Hidrojen peroksitin kararsızlığı nedeniyle, konsantrasyon 24 saat sonra %50 ila %70 hücre ölümüne neden olacak bir seviyeye optimize edilmelidir. Bu konsantrasyon genellikle 75 ila 100 mikromolar arasındadır. DNA hasarı ile hücre ölümünü indüklemek için, serebellar granül nöronlarını 24 saat içinde% 50'den fazla hücre ölümüne neden olmak için 10 mikromolar kamptoteksin ile tedavi edin.

Serebellar granül nöronlarında düşük potasyumun neden olduğu nöronal apoptoz için, in vitro yedi gün sonra 25 milimolar potasyum içeren ortamı beş milimolar potasyum içeren düşük potasyum ortamına değiştirin. Nöronlar, kaplama sırasında üç MOI'de RFP için lentivirüs ile transdüksiyon edildi. Yedi günde in vitro olarak sabitlenir ve boyanır.

RFP sinyali MAP2 ve Hoechst'in birlikte lokalizasyonunun, lentivirüsler tarafından tamamen dönüştürülen sağlıklı nöronları gösterdiği gösterilmiştir. Burada gösterilen görüntüler, toksisiteyi ölçmek için farklı MOI adenovirüs ile enfekte olmuş nöronların canlı ölü tahlil analizlerini temsil etmektedir. 25 ile 50 arasında bir MOI'de LacZ eksprese eden adenovirüs ile enfekte olmuş serebellar granül nöronları, minimum toksisiteyi korurken maksimum verimlilik sağlar.

Bu MOI'de enfekte olurken hücre sağkalımında kontrole kıyasla %1'den daha az fark görülür. Bu rakamlar, hücre ölümünü indüklemek için NMDA ile tedavi edilen kontrol serebellar granül nöronlarının ve serebellar granül nöronlarının Hoechst boyamasını göstermektedir. NMDA tedavisi ile piknotik çekirdeklerin oluşumuna dikkat edin.

Bu hücre ölümünün bir göstergesidir ve 100 mikromolar NMDA ve 10 mikromolar glisin ile tedaviden 24 saat sonra kültürün yaklaşık% 50'sinde görülebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, altı fare patlaması ile iki buçuk saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu tekniği uygularken, kültür kontaminasyonu riskini en aza indirmek için gerektiği gibi aseptik teknik ve zincirleme cerrahi aletlerin kullanılması önemlidir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların birincil fare nöronlarında nöronal gelişim ve nöronal hasarı incelemesinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, serebellar granüler nöronları kültürleyebilmeli, virüsleri kullanarak genetik olarak manipüle edebilmeli ve çeşitli nöral yaralanma mekanizmalarını indükleyebilmelisiniz. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen bir genin eksitotoksisite, oksidatif stres veya DNA hasarına yanıt olarak hücre sağkalımını artırıp artırmadığı gibi soruları yanıtlamak için immünofloresan veya hücre canlılığı deneyleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.