Name: Elektrokonvulsif nöbetler fareler ve onların Hippocampi ayırma nöbet kaynaklı değişiklikleri postsinaptik yoğunluğu proteinlerde incelemek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Öğrenin farelerde elektrokonvulsif nöbet indüksiyonu ve hipokampal fraksiyonasyon yöntemini. Bu teknik, postsinaptik yoğunluktaki protein değişikliklerini inceleyerek nöroplastisite mekanizmalarını araştırmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr. Eric C. Bolton onun santrifüj ayırma ve Dr. Graham H. Diering için bize PSD ayırma için küçük ölçekli kuralıyla sağlamak için John Hopkins Üniversitesi'nde Dr. Richard L. Huganir'ın laboratuarında kullanmak izin verdiğiniz için teşekkür ederim.

Hayvan konular da dahil olmak üzere tüm deneysel prosedürler kurumsal hayvanlar bakım ve kullanım komite toplantısında Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. bir sıçan koloni Bakımı
<ol><li>(Bkz. Tablo reçetesi) Sprague-Dawley Rat doğurmak ve 12-h koyu döngüsü ve gıda ve su ad libitum erişim ile standart koşullarda proje.</li>
	<li>Fare pups postnatal gününde (P) 28 vazgeçirmek ve 2-4 erkek veya kadın littermates gruplar halinde onları evi.</li>
	<li>Erkek rats kuyruk toksik olmayan kalıcı bir siyah kalem tanımlama için WITH mark.</li>
	<li>Haftada 3 kez erkek rats tartmak ve onların bodyweights kaydedin.</li>
</ol>2. bir ECS makine hazırlanması
<ol><li>07:30 at hayvan Hazırlık odasında tezgah dezenfekte ve bankta bir ECS makine (pulse jeneratörü) yerleştirin.</li>
	<li>Bir kapak ile temiz, boş bir kafeste 200-250 g ağırlığında bir bireysel erkek fare yerleştirin. ECS indüksiyon ile tedavi olmak tüm erkek rats için bu işlemi yineleyin. İzin vermek için 30 dk alıştırmak rats.</li>
	<li>Fareler onların kafeslerde habituating iken, bir darbe jeneratör ECS indüksiyon için 100 bakliyat/s, bir darbe genişliği 0.5 MS, bir şok süresi 0,5 frekansı ayarla s ve 55 mevcut mA (şekil 1A).</li>
	<li>Darbe üreteci hazır olun "RESET" düğmesine basıyorum ve "Hazır" düğmenin ışığı yanar sağlanması. Kulak klipleri bir darbe jeneratör bağlı değil ve sonra bir kaç saniye için "Şok" düğmesine emin olun. Not: Bu noktada, nabız jeneratör ECS indüksiyon için hazırdır.</li>
	<li>Kulak klipleri darbe jeneratör takın.</li>
</ol>3. akut ECS indüksiyon
Not: Bkz. Resim 1B, üst panel.
<ol><li>Kulak klipler steril serum fizyolojik ile ıslak ve onlar doygun emin olun.</li>
	<li>Ne dedikleri kulakları ile steril serum fizyolojik serum batırılmış gazlı bez içinde sarma tarafından ıslak. Sonra onları ıslak gazlı bez çıkarın.</li>
	<li>Kulak, ana kıkırdak grubun ötesinde pozisyon başına bir küçük resim ekleyin.</li>
	<li>ECS makinede doğru bir döngü kurulur onaylamak; Eğer değilse, bir hata iletisi veya bir okuma "1"-ecek gözükmek üstünde belgili tanımlık makine.</li>
	<li>Kalın, metal olmayan bir eldiven giymek. Fareyi yavaşça eldivenli elinde tutarken, bir kaç saniye için "Şok" düğmesine ve yavaş yavaş nöbet gözlemlemek için fare üzerinde kavrama bırakın. Sham "nöbet" için (NS) kontrol fare aynı şekilde başa ama geçerli teslim etme.</li>
	<li>Clonus başlar gibi kulak klipleri çıkarın ve "ağız ve yüz hareketleri" içerir "başını sallayarak (Aşama 1), kafa" (Aşama 2), "forelimb clonus" gözden geçirilmiş bir Racine'in ölçek22 göre nöbet davranış kayıt (evre 3), "yetiştirme forelimb clonus ile" (4 kademe) ve "yetiştirme ve forelimb clonus ile düşen" (sahne 5). Nöbet yaklaşık 10 sürmelidir s; kayıt zamanlayıcı kullanarak nöbet süresi.</li>
	<li>Nöbet fesih, fare için ev onun kafes dönmek. Fareyi fare kurtarma nöbetler en emin olmak başka bir 5 min için izleyin. Onu kafeste tek başına yer tutmak ve kafes kurtarma odasına dönün.</li>
	<li>Sonraki fare üzerinde ECS indüksiyon yineleyin.</li>
	<li>Fareler kalan gün ve sabahları en az bir kez ve bir kez onlar are euthanized için deneyler kadar ertesi gün öğleden sonra boyunca izlemek. Not: ECS indüksiyon yöntemi bir olası yan dikkat gerektiren etki olarak, klinik belirtiler için neden olabilir. Örneğin, ECS indüksiyon Protokolü 15 s ve neden gereksiz sıkıntı fareler için daha uzun ömürlü nöbetlere neden. Bu durumda, diazepam (10 mg/kg, IP) veya Fentobarbital (25-30 mg/kg, IP) kullanarak alma işlemini sonlandırın. Fareler solunum güçlüğü veya şiddetli davranış anormallikleri nöbet bırakma takip geliştirirseniz, onları işten çıkarma tarafından takip karbon dioksit Solunduğunda ötenazi.</li>
</ol>4. kronik ECS indüksiyon
Not: Resim 1B, alt paneli bakın.
<ol><li>Günlük sabah yedi gün üst üste adımlarda 1-3, yukarıda açıklandığı gibi aynı zamanda bir ECS neden.</li>
	<li>Fareler iki kez bir gün sonra evlerine iade kafesleri monitör.</li>
</ol>5. homojenizasyon ve sıçan Hippocampi ayırma
Not: Şekil 2bakın.
<ol><li>320 mM Sükroz, 5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, içeren bir taze homojenizasyon arabelleği (a çözüm) hazırlamak 200 nM okadaic asit ve proteaz inhibitörleri. Filtreleri bir 0,22 µm gözenek boyutu ile vakum filtrasyonu için kullanarak arabellek filtre sterilize et ve buz üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>Belirli bir zamanda ECS akut veya kronik ECS (şekil 1) aşağıdaki noktası, 5-10 dk, bir Giyotin kullanarak işten çıkarma tarafından takip için CO2 Solunduğunda sıçan ötenazi.</li>
	<li>Beyin kaldırmak ve hippocampi buzda,23,24daha önce açıklandığı gibi yerleştirilen metal plaka üzerinde incelemek.</li>
	<li>30 mm doku kültürü üzerine bir sıçan gelen yer iki hippocampi çanağı ve onları küçük parçalara makas kullanarak kıyma.</li>
	<li>Kıyılmış hippocampi 1 mL pipet kullanarak bir Manuel cam homogenizer aktarmak ve buz gibi homojenizasyon arabellek (çözüm A, adım 5.1) 1 mL ekleyin. Yuvarlak bir havaneli ile cam homogenizer yerleştirin. Cam homogenizer buz üzerinde olmakla birlikte, kadar küçük parçalar halinde Hipokampal doku ortadan yavaşça ve sürekli yukarı ve aşağı 1 dk. için 10 - 15 kez havaneli üzerinde inme.</li>
	<li>1-mL pipet kullanarak 1.7 mL microcentrifuge tüp homogenate aktarmak ve çözünmez doku ve hücre çekirdeği (P1 kesir) içeren Pelet homogenate vasıl 800 x g 4 ° C'de postnuclear süpernatant (S1 kesir) ayırmak için 10 dk santrifüj kapasitesi. 1 mL pipet kullanarak iki ayrı, yeni 1.7 mL microcentrifuge tüpler 50 µL ve S1 fraksiyonunun 950 µL aktarın ve bu tüpler buza depolayın. P1 kesir Pelet buza kaydedin.</li>
	<li>S1 kesir (950 µL) 13,800 x g ve çözünür sitozolik protein ile zenginleştirilmiş süpernatant (S2 kesir), ayırmak için 4 ° C de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve Pelet (P2 kesir), synaptosomal proteinler de dahil olmak üzere membran bağlı proteinler ile zenginleştirilmiş. 1-mL pipet kullanarak yeni bir 1,7 mL microcentrifuge S2 kesir aktarın ve buza depolayın.</li>
	<li>Pelet (P2 kesir) 1-mL pipet kullanarak buz gibi arıtılmış su 498 µL içinde resuspend. 1 M HEPES (pH 7,4) 2 µL eklemek 4 mM HEPES (pH 7,4) son bir konsantrasyon ulaşmak için 20 µL pipet kullanarak. 30 dk. deposu için ajitasyon ile 4 ° C'de resuspended P2 kesir buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>BCA tahlil kullanarak S1, S2 ve P2 kesirler protein konsantrasyonu belirlemek. 50 mM HEPES (pH 7,4) 1 mg/mL konsantrasyonu elde etmek ve-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak için her kesir ekleyin veya PSD yalıtmak için P2 kesir işlemek.</li>
</ol>6. yalıtım PSD gelen ham membran proteini (P2) kesir
<ol><li>25.000 x g ve 4 ° C 20 dk P2 kesir (500 µL) santrifüj kapasitesi lysed süpernatant (LS2 kesir) ve lysed Pelet (LP1 kesir) ayırmak için. LS2 kesir 1 mL pipet kullanarak bir yeni 1.7 mL microcentrifuge tüp için aktarın ve buza depolayın.</li>
	<li>LP1 Pelet 250 µL % 1 deterjan 1 x 1 mL pipet kullanarak PBS arabellek ile karışık 250 µL 50 mm HEPES (pH 7,4) resuspend. 15 dakika nazik ajitasyon ile 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Resuspended LP1 Pelet 25.000 x g ve süpernatant (PSD kesir) Pelet (PSD kesir) ayırmak için 4 ° C'de 3 h için santrifüj kapasitesi. 1.7-mL microcentrifuge Tube süpernatant kaldırmak ve PSD Pelet 50 mM HEPES (pH 7,4) 100 µL içinde resuspend 200 µL pipet kullanarak.</li>
	<li>LS2, Sigara-PSD ve BCA tahlil kullanarak PSD kesirler protein konsantrasyonu belirlemek. 50 mM HEPES (pH 7,4) 1 mg/mL konsantrasyonu elde etmek ve-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak için her kesir ekleyin. Not: tüm çözümler adım 5-6 (Yani, çözüm A, HEPES tampon ve PBS arabellek) kullanılan arıtılmış su iyonik ve organik kirleticiler ve parçacıklar ücretsiz ile yapılmalıdır.</li>
</ol>7. Batı kurutma
<ol><li>Her protein fraksiyonu buz çözme. Her kesir (S2, P2 ve PSD 1 mg/ml) 12 µL 20 µL pipet kullanarak bir yeni 1.7 mL microcentrifuge tüp için transfer.</li>
	<li>5 x SDS örnek arabelleği 3 µL ekleyin ve 75 ° c 30 dk içinde bir su banyosu için kuluçkaya. Örnek oda sıcaklığında (RT) aşağı ne yapıyorsun?</li>
	<li>Protein örneği 10 µL % 4-20 degrade 15-iyi tarak SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) jel 20 µL pipet kullanarak her kuyunun içine yükleyin. SDS-sayfa aparatı ve arabellek çalışan 80-100 V jel çalıştırmak (25 mM Tris, 190 mM glisin ve % 0.1 SDS; pH 8.3). Not: Her jel protein örnekleri NS fareler ve ECS rats akut veya kronik ECS takip farklı zaman noktalarda içermelidir.</li>
	<li>Proteinler SDS sayfasından jel transfer polivinil difluoride (PVDF) membran içinde 25-30 V, aktarım cihazları (60 mA) için 9-12 h aktarma arabelleği (25 mM Tris, 190 mM glisin ve % 20 metanol; pH 8.3).</li>
	<li>PVDF membran aktarım cihazları kaldır ve RT. çok amaçlı rotator üzerinde 5 min için Tris arabelleğe alınmış serum (TBS) yıkayın</li>
	<li>Membran % 5 süt engellemek ve % 0.1 ara-20 TBS 1 h. için kuluçkaya bu birincil antikor (Tablo 1) çamaşır arabellek içinde (% 1 süt ve % 0.1 ara-20 TBS) gecede 4 ° C çok amaçlı rotator üzerinde (dilutions için Malzemeler tablo bakınız).</li>
	<li>Membran 10 min için 4 kez yıkama arabellekte yıkayın ve ardından horseradish peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya-Birleşik arabellek için 1S RT. çok amaçlı rotator yıkama içinde ikincil antikorlar</li>
	<li>Membran 10 min için 4 kez yıkama yıkama arabellek ve sonra TBS ile 5 min için.</li>
	<li>Membran ile 1 min için geliştirilmiş chemifluorescence substrat kuluçkaya ve röntgen filmi ile maruz kalmaktadır. Film işlemciye sahip maruz filmi banyo.</li>
</ol>8. Batı lekesi miktar
<ol><li>İnceden inceye gözden geçirmek Western blot TIFF dosyası olarak ve bu dosyayı bilgisayarınıza kaydedin.</li>
	<li>"Dosya," "Açık resim," sağ ok "gri ölçekli." altında gri tonlamalı bir görüntüyü olarak ImageJ programda Western blot dosya açmak</li>
	<li>ImageJ araç çubuğundan dikdörtgen seçim aracı seçin ve bir tek Western blot grup ilgi bir proteinin kapsar bir dikdörtgen çizin.</li>
	<li>"Analiz" altında "alan ve seçilen bir grubun ortalama yoğunluğu elde etmek için ölçü birimi" vurmak.</li>
	<li>Dikdörtgenin boyutunu ve şeklini değiştirmeden bir arka plan alanına taşıyın. 8.4 alan ve bir arka plan ortalama yoğunluğu arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Ortalama yoğunluk değeri, bir arka plan grubu bu bir Western blot orkestra'arka plan düşülen grup yoğunluk ilgi protein veren çıkarma.</li>
	<li>İlgi için tüm Western blot bantlarında 8.2 8.6 adımları yineleyin.</li>
	<li>Protein ilgi grubu arka plan düşülen yoğunluğu α-tübülin gibi bir temizlik gen ürünü arka plan düşülen grup yoğunluğu tarafından bölmek; Bu adım faiz protein normalleştirilmiş değerini verir.</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada, biz onların hippocampi nöronal aktivite küresel uyarılması ortaya çıkarır bir ECS indüksiyon yöntemi Sıçanlarda açıklayın. ECS Elektrokonvulsif terapi, klinik olarak insanlar1,2,3' te uyuşturucu ateşe dayanıklı depresif bozuklukların tedavisinde kullanılır hayvan bir modeldir. Elektrokonvulsif terapi şiddetli depresyon tedavisi için kullanılmasına rağmen kesin altta yatan mekanizma belirsizdir. ECS depressant-gibi davran...

Elektrokonvulsif terapi ağır ilaca dirençli depresyon, bipolar depresyon, Parkinson hastalıkları ve şizofreni1,2de dahil olmak üzere büyük depresif bozuklukların tedavisinde kullanılmaya başlanmıştır. Bu terapi, nöbet elektrik uyarıcı epicranial elektrotlar1,2,3üzerinden imzalat hastalar başkanı teslim tarafından oluşturulur. ECS tekrarlayan yönetimini ilaca dirençli depresif bozukluklar1,2,3' e klinik olarak yararlı olmuştur. Ancak, uzun vadede etkinlik insanlarda antidepresan etkisi altında yatan kesin mekanizması zor kalmıştır. ECS Elektrokonvulsif terapi hayvan bir modeldir ve tedavi onun mekanizma araştırmak için yaygın olarak kullanılır. Rodents, akut ECS ve kronik ECS tedavi hippocampi yetişkin neurogenesis teşvik ve hangi bilişsel esneklik ilerleme-e doğru katkıda bulunmak olasıdır neural ağ4,5, yeniden düzenleyebilirsiniz. Ayrıca, beyin aktivitesi ECS tarafından küresel yükselmesine Tutanaklar, bolluk değiştirir gibi bir beyin neurotropic faktörü6ve metabotropic Glutamat reseptör 17 ve N-metil-D-aspartat dahil olmak üzere birden fazla protein elde (NMDA) tipi Glutamat reseptör alt birimleri7. Bu değişiklikler synapse numarası, yapısı ve Hipokampus7,8,9gücü uzun vadeli modifikasyonu arabuluculuk katılmaktadırlar.
ECS modellerinde, elektriksel stimülasyon jeneralize Tonik klonik nöbetler10,11uyandırmak için Stereotaxic implante elektrotlar, kornea elektrotlar veya kulak elektrotlar yoluyla kemirgenler teslim edilir. Elektrot stereotaksik implantasyon beyin ameliyatı içerir ve deneyci'nın yaralanma en aza indirmek için cerrahi becerilerini geliştirmek için önemli ölçüde zaman gerektirir. Daha az invaziv kornea elektrotlar kornea aşınma ve kuruluk neden olabilir ve anestezi gerektirir. Çünkü onlar kemirgen cerrahi ve anestezi olmadan kullanılabilir ve en az yaralanmalara neden kulak-küçük elektrotlar kullanımı bu sınırlamalar atlar. Gerçekten de, geçerli uyanık teslim fareler ile kulak-küçük elektrotlar güvenilir sahne 4-5 Tonik-klonik nöbetler neden olmaktadır ve onların hippocampi10sinaptik proteinler değiştirir bulduk.
Kemirgenler belirli beyin bölgelerinde sinaptik proteinlerin ECS kaynaklı bereket incelemek için kendi algılama ve miktar için en uygun deneysel yöntemleri seçmek önemlidir. Beyin hücre altı ayırma çözünür sitozolik protein ham yalıtımı için sağlar; zar proteinleri; Organel sınırları proteinler; ve proteinler PSD12,13,14gibi özel hücre altı yapıları arasında bile. PSD bir yoğun ve iyi organize edilmiş hücre altı sinaptik proteinler ve postsinaptik membran12,13,15yakınındaki yüksek konsantrasyonlu nöronlar malıdır. Yalıtım PSD PSD bereket ve postsinaptik Glutamat reseptörlerinin, iskele proteinler ve sinyal iletim proteinler PSD12 fonksiyon dinamik değişiklikleri beri zenginleştirilmiş sinaptik proteinlerin çalışma için yararlıdır , 15 , 16 , 17 sinaptik plastisite ve çeşitli nörolojik bozukluklar17,18içinde gözlenen synaptopathy ile ilişkili mısınız. Önceki hücre altı ayırma yöntemi PSD arındırmak için kullanılır beyin ham membran kısmını dan deterjan çözünmez kesir yalıtım tarafından Sükroz degradeler14, aralıklarla fark dahil. 19. o kemirgen büyük miktarlarda beyin14,19istemek bu geleneksel yöntemle büyük sorun olduğunu. PSD kesir tedavi başına izole etmek için 10-20 kemirgenler hazırlanması geniş maliyet ve zaman yatırım gerektirir ve birçok tedavi ise pratik olarak mümkün değildir.
Bu zorluğu aşmak için biz doğrudan olmadan Sükroz degrade Santrifüjü20,21, PSD kesir yalıtır ve PSD yalıtım için uygun tek bir sıçan hippocampi revize daha basit bir yöntem adapte olması beyin. Bizim küçük ölçekli PSD ayırma yöntemi hakkında verimleri 30-50 µg 2 hippocampi, immunoprecipitation ve Western Blot de dahil olmak üzere çeşitli biyokimyasal testleri kullanmak için yeterli dan PSD proteinlerin. Western Blot PSD zenginleştirme (PSD-95) postsinaptik yoğunluğu protein 95 ve presynaptic işaret synaptophysin ve çözünür sitoplazmik protein α-tübülin dışlanması ifşa tarafından izole için bizim yöntem başarısını gösterir. Bizim ECS indüksiyon ve küçük ölçekli PSD ayırma yöntemleri diğer kemirgen beyin bölgelerine kolayca uyarlanabilir ve PSD proteinlerin ifade ECS etkilerini değerlendirmek için nispeten basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>Spargue-Dawley sıçan</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>ECS malzemeleri</td></tr><tr><td>Bir nabız jeneratörü</td><td>Ugo Bsile, Comerio, İtalya</td><td>57800</td><td>ECS</td>,</tr><tr><td>MilliQ su arıtma sistemi</td><td>EMD Millipore</td><td>Z00Q0VWW</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>sağlar Sükroz</td><td>Em bilimi</td><td>SX 1075-3</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>Na4O7P2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>221368</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E9884</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H0527</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>Okadaik asit</td><td>TOCRIS</td><td>1136</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>Halt Proteaz İnhibitörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>NaVO3</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72060</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>EMD Millipore Sterito Steril Vakumlu Şişe Üstü Filtreler</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS05RE</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>İris Makas</td><td>WPI (Dünya Hassasiyeti Aletler)</td><td>500216-G</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>30 mm doku kültürü kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>Cam homojenizatör ve teflon havaneli</td><td>VWR</td><td>89026-384</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>1.7 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT / XF Santrifüj&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004521</td><td>Hücre altı fraksiyonasyon malzemeleri</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Reaktifi A, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td> <td># 23228</td><td>Western blot malzemeleri</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Reaktifi B, 25 mL</td><td>Thermo Fisher</td> <td># 1859078</td><td>Western blot malzemeleri</td></tr><tr><td>SDS-poliakrilamid jel (SDS-PAGE)</td> <td>BIO-RAD</td><td>#4561086S</td><td>Western blot malzemeleri</td></tr><tr><td>Koşu Tampon</td><td>Laboratuvarda</td><td></td> yapılmıştır <td>Western blot malzemeleri.&nbsp;</td></tr><tr><td>MiniPrekast Jeller için Mini-PROTEAN Tetra Dikey Elektroforez Hücresi, 4 jelli</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>Western blot malzemeleri</td></tr><tr><td>Polivinil diflorür (PVDF) membranı&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot malzemeleri</td></tr><tr><td>Transfer Tamponu</td><td>Laboratuvarda</td><td></td> yapılan <td>Western blot malzemeleri.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Western blot malzemeleri</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td>Western blot malzemeleri</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>436143</td><td>Western blot malzemeleri</td></tr><tr><td>Metanol ve nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Western blot,</td></tr><tr><td>PSD izolasyonu için</td><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td> deterjan</tr> malzemeleri <tr><td>Mini Trans-Blot Modülü&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703935</td><td>Western blot malzemeleri</td></tr><tr><td>Yağsız hazır kuru süt</td><td>Çok değerli</td><td></td><td>Western blot malzemeleri</td></tr><tr><td>Çok amaçlı döndürücü&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model-2314</td><td>Western blot,</td></tr><tr><td>Hyblot CL Otoradyografi Filmi</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>E3018 (1001365)</td><td>Western blot malzemeleri</td></tr><tr><td>Geliştirilmiş kemifloresan substrat & nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td>Western blot</td></tr>, <tr><td>bir Konica SRX-101A film işlemcisi</td> sağlar <td>KONICA MINOLTA</td><td>SRX-101A</td><td>Western blot malzemeleri</td></tr><tr><td><güçlü>Antikorun adı</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Hücre Sinyali</td><td>#2507</td><td>Antikor seyreltmesi = 1:500 - 1.000, zaman = 9 - 12 saat, Reaksiyon Sıcaklığı = 4 & derece; C, Konukçu Tür = Tavşan</td></tr><tr><td>Sinaptofizin</td><td>Hücre Sinyali</td><td>#4329</td><td>Antikor seyreltmesi = 1:500 - 1.000, zaman = 9 - 12 saat, Reaksiyon Sıcaklığı = 4 &deg; C, Konukçu Tür = Tavşan</td></tr><tr><td>alfa-Tubulin</td><td>Santacruz</td><td>SC-5286</td><td>Antikor seyreltmesi = 1:500 - 1.000, zaman = 9 - 12 saat, Reaksiyon Sıcaklığı = 4 &deg; C, Konakçı Tür = Fare</td></tr><tr><td>GluN2B</td><td>Neuromab</td><td>75-097</td><td>Antikor seyreltmesi = 1:500 - 1.000, zaman = 9 - 12 saat, Reaksiyon Sıcaklığı = 4 &deg; C, Konakçı Tür = Fare</td></tr><tr><td>GluA2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Sab 4501295</td><td>Antikor seyreltmesi = 1:500 - 1.000, zaman = 9 - 12 saat, Reaksiyon Sıcaklığı = 4 &derece; C, Konukçu Tür = Tavşan</td></tr><tr><td>STEP</td><td>Santacruz</td><td>SC-23892</td><td>Antikor seyreltmesi = 1:200 - 500, zaman = 9 - 12 saat, Reaksiyon Sıcaklığı = 4 &deg; C, Konukçu Tür = Fare</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Eşek Anti-Fare IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratuvarı</td><td>715-035-150</td><td>Antikor seyreltmesi = 1:2.000-5.000, zaman = 1 saat, Reaksiyon Sıcaklığı = RT, Konukçu Tür = Eşek</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Tavşan IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratuvarı</td><td>711-035-152</td><td>Antikor seyreltmesi = 1:2.000-5.000, zaman = 1 saat, Reaksiyon Sıcaklığı = RT, Konukçu Tür = Eşek</td></tr></tbody></table>

elektrokonvulsif nöbetler fareler ve onların hippocampi ayırma nöbet kaynaklı değişiklikleri postsinaptik yoğunluğu proteinlerde incelemek için

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Elektrokonvulsif nöbet (ECS) Elektrokonvulsif terapi, şiddetli depresyon için en etkili tedavi deneysel hayvan bir modeldir. ECS düşük mortalite ve nöronal ölüm ile jeneralize Tonik klonik nöbetler neden olmaktadır ve ekran anti-epileptik ilaçlar için yaygın olarak kullanılan bir model. Burada, bir ECS indüksiyon yöntemi açıklamak hangi kısa bir 55-mA akım 0,5 için teslim edilir içinde s erkek için 200-250 g ağırlığında kulak-küçük elektrotlar aracılığıyla sıçanlar. Üretilen bu tür ikili stimülasyon sahne yaklaşık 10 süren 4-5 klonik nöbetler s. Akut veya kronik ECS bırakma sonra en rats davranışsal ayırt olmak kurtarıldı "nöbet" fareler sham. ECS genel olarak beyin aktivitesini yükseltir çünkü da faaliyet bağlı değişiklikler sinaptik proteinlerin ve sinaptik gücü birden çok yöntem kullanarak üzerindeki etkileri incelemek için kullanılmıştır. Özellikle, bu özel sinaptik yapısı, sinaptik proteinlerin bereket kantitatif tayin postsinaptik yoğunluğu (PSD), Western Blot birlikte hücre altı ayırma sağlar. Kemirgen beyin büyük miktarda gerektiren bir önceki ayırma yöntemi aksine, biz burada Sükroz degrade Santrifüjü olmadan tek bir sıçan hippocampi dan PSD yalıtmak için küçük ölçekli ayırma yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, biz izole PSD kesir postsinaptik membran proteinlerinin, PSD95, GluN2B ve GluA2 de dahil olmak üzere içerir gösterir. Presynaptic işaretçisi synaptophysin ve çözünür sitoplazmik protein α-tübülin başarılı PSD yalıtım gösteren PSD kesir dışlandı. Ayrıca, kronik ECS GluN2B ifade bizim küçük ölçekli PSD ayırma yöntemi genetik, farmakolojik veya mekanik tedaviler sonra Hipokampal PSD proteinler tek bir sıçan gelen değişiklikleri algılamak için uygulanabilir olduğunu belirten PSD olarak azalmıştır .

Ayrıntılı yordam kullanılarak sunulan burada, bir elektrik çarpması (55 anne, 0,5 için 100 bakliyat/s s) kulak-küçük elektrotlar indüklenen yinelenmeyen sahne ile 4-5 Tonik-klonik nöbetler içinde rats (şekil 1A-B) teslim. Toplam 8 sıçan akut ECS indüksiyon alınan ve sahne 4-5 Tonik-klonik nöbetler görüntülenir. Nöbetler hakkında 10 sürdü s ve 1-2 dk içinde nöbet bırakma kurtarılan tüm rats. Sahte "yok nöbet" fareler bir elektrik çarpması alma...

Elektrokonvulsif nöbet (ECS) Elektrokonvulsif terapi şiddetli depresyon için bir deneysel hayvan modeldir. ECS synaptogenesis ve sinaptik plastisite yol hipokampüs, faaliyet genel olarak uyarır. Burada, ECS indüksiyon Sıçanlarda nöbet kaynaklı sinaptik protein değişimler incelemek için kendi hippocampi hücre altı ayırma yöntemleri açıklanmaktadır.

Elektrokonvulsif nöbetler fareler ve onların Hippocampi ayırma nöbet kaynaklı değişiklikleri postsinaptik yoğunluğu proteinlerde incelemek için

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

Elektrokonvülsif nöbet indüksiyonu ve ardından gelen hipokampüsün küçük ölçekli fraksiyonasyonunun genel amacı, sıçan beyninde global nöbet aktivitesi oluşturmak ve nöbet aktivitesinin hipokampüsün postsinaptik yoğunluğundaki proteinlerde meydana getirdiği değişiklikleri incelemektir. Bu yöntem, nöbet sonrası belirli beyin bölgelerinde hangi sinaptik proteinlerin regüle olduğu ve bu regülasyonun nöroplastisiteye katkıda bulunup bulunmadığı gibi, araştırmanın nöral süreçlerine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu elektrokonvülsif nöbet indüksiyon protokolünün temel avantajı, nöronal ölüm gerçekleşmeden, kemirgen beyin aktivitesinin global artışını canlı bir şekilde indükleyebilmemizdir.Prosedürü, Dr. Hee Jung Chung'un laboratuvarından ben ve Han Gil Jeong uygulamalı olarak göstereceğiz. Bu prosedüre başlamak için, erkek bir sıçanı kapaklı, temiz ve boş bir kafese yerleştirin. Sıçanın 30 dakika boyunca alışmasına izin verin, ardından pulse jeneratörünü ECS indüksiyonu için ayarlayın.Sıfırlama düğmesine basarak pals jeneratörünü hazırlayın ve hazır düğmesinin yandığından emin olun. Kulak klipslerinin pals jeneratörüne takılı olmadığından emin olun. Ardından, şok düğmesine birkaç saniye boyunca basın ve sonra kulak klipslerini pals jeneratörüne takın.Bu adımda, kulak klipslerini steril serum fizyolojik ile ıslatın ve tamamen doyduklarından emin olun. Ardından, sıçanın kulaklarını serum fizyolojik emdirilmiş gazlı bezle sararak steril serum fizyolojik ile ıslatın. Kulaklar ıslandıktan sonra gazlı bezi çıkarın.Klipleri her kula bir adet gelecek şekilde takın ve ana kıkırdak bandının ötesine konumlandırın. Şok düğmesine birkaç saniye boyunca basın ve nöbeti gözlemleyin. Sham (yalancı) grup için, yani nöbet kontrolü yapılmayan durum için, sıçana aynı şekilde işlem uygulayın ancak akım vermeyin.Klonus başladığında, kulak klipslerini ayırın ve nöbet davranışını bir ile beş arasındaki revize edilmiş Racine ölçeğine göre kaydedin. Bu ölçek, dördüncü evrede dört ekstremite klonusu ile birlikte arka ayaklar üzerinde yükselmeyi; beşinci evrede ise dört ekstremite klonusu ile birlikte arka ayaklar üzerinde yükselip düşmeyi kapsar. Nöbet yaklaşık 10 saniye sürmelidir.Nöbet süresini bir zamanlayıcı kullanarak kaydedin. Nöbet sona erdikten sonra sıçanı kendi kafesine geri koyun. Sıçanın nöbetten tamamen kurtulduğundan emin olmak için beş dakika daha gözlemleyin.Hayvanı kafeste tek başına tutun ve kafesi iyileşme odasına geri götürün. Bu prosedürde, bir sıçandan alınan iki hipokampusu 30 milimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin ve makas kullanarak küçük parçalar halinde kıyın. Ardından, kıyılmış hipokampusları manuel bir cam homogenizatöre aktarın ve bir mililitre buz gibi soğuk homogenizasyon tamponu ekleyin.Ardından, cam bir homogenizatöre yuvarlak bir piston yerleştirin. Cam homogenizatör buz üzerindeyken, hipokampal dokunun küçük parçaları kaybolana kadar bir dakika boyunca 10 ila 15 kez, pistonu nazikçe ve istikrarlı bir şekilde yukarı aşağı hareket ettirin. Daha sonra, homogenatı 1 mL'lik bir pipet kullanarak 1,7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve çözünmeyen doku ile çekirdekleri içeren peletten postnükleer süpernatantı ayırmak için homogenatı 4 °C'de 10 dakika boyunca 800 ×g hızında santrifüjleyin.Ardından, S1 fraksiyonunun 50 µL ve 950 µL'sini iki ayrı yeni 1,7 mL mikro santrifüj tüpüne aktarın ve bu tüpleri buz üzerinde saklayın. Ayrıca, P1 fraksiyonu peletini buz üzerinde muhafaza edin. Sonrasında, sitozolik çözünür proteinlerce zengin süpernatantı ve sinaptozomal proteinler dahil olmak üzere membrana bağlı proteinlerce zengin peleti ayırmak için 950 µL'lik S1 fraksiyonunu 13.800 ×g'de, 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.S2 fraksiyonunu yeni bir 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde saklayın. Ardından, P2 fraksiyonu peletini 498 mikrolitre buz gibi soğuk saflaştırılmış su içinde yeniden süspanse edin. Nihai konsantrasyonu dört milimolar heeps olacak şekilde iki mikrolitre bir molar heeps ekleyin.Süspansiyonu dört degrees Celsius'te, ajitasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra, yeniden süspanse edilen P2 fraksiyonunu buz üzerinde saklayın. Bu adımda, lizize süpernatan ve lizize peleti ayırmak için P2 fraksiyonunu 25, 000 times G ve dört degrees Celsius'te 20 dakika boyunca santrifüjleyin.LS2 fraksiyonunu yeni bir 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde saklayın. Ardından, LP1 peletini 250 mikrolitre 50 milimolar heeps, 250 mikrolitre yüzde bir deterjan ve 1 X PBS karışımıyla yeniden süspanse edin. Süspansiyonu dört derece santigrat sıcaklıkta, hafif ajitasyon ile 15 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, non-PSD fraksiyonu süpernatantını PSD fraksiyonu peletinden ayırmak için yeniden süspanse edilen LP1 peletini 25,000 ×g'de, 4 °C'de 3 saat boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı 1,7 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve PSD peletini 100 µL 50 mM HEPES içinde yeniden süspanse edin. Bu şekildeki temsilci western blotlar; sham, nöbet geçirmeyen ve akut ECS uygulanan sıçanların hipokampuslarından elde edilen S2, P2 ve PSD fraksiyonlarındaki NMDA reseptör alt birimi GluN2B, AMPA reseptörü GluA2 ve STEP 61 protein ekspresyonlarını göstermektedir.Sitozolik çözünür protein alfa-Tubulin, S2 fraksiyonunda zenginleşmiştir. Sinaptofizin presinaptik bir vezikül proteinidir ve kaba membran P2 fraksiyonunda zenginleşmişken PSD fraksiyonunda zenginleşmemiştir; buna karşın PSD-95 hem P2 hem de PSD fraksiyonlarında zenginleşmiştir. Burada, akut ECS'den 3 ve 24 saat sonra P2 ve PSD fraksiyonlarındaki GluN2B ve GluA2 miktarlarının kantifikasyonu gösterilmektedir.P2 fraksiyonundaki GluN2B ve GluA2 ekspresyonu, S2 fraksiyonundaki alpha-Tubulin'e göre normalize edildi. PSD fraksiyonundaki GluN2B ve GluA2 ekspresyonu ise PSD fraksiyonundaki PSD 95'e göre normalize edildi. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde beş ila altı saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü takiben, ECS tarafından başka hangi sinaptik proteinlerin değiştirildiğine dair ek soruları yanıtlamak amacıyla, protein karışımına dayalı kütle spektrometrisi gibi analizler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, nörolojik hastalıklar alanındaki araştırmacıların, nörolojik hastalıkların transgenik modellerinde sinaptik disfonksiyonun altında yatan mekanizmaları keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra; rodentlerde ECS'nin nasıl indükleneceği, hipokampuslardan nasıl homojenizasyon ve PSD fraksiyonasyonu yapılacağı ve ECS sonrası sinaptik proteinlerdeki değişikliklerin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

electroconvulsive-seizures-rats-fractionation-their-hippocampi-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, epilepsiye bağlı sıçanlarda epileptik nöbetlerin elektroensefalografik (EEG) kaydını göstermektedir. Ventral hipokampusa implante edilen elektrotlu bir sıçan, EEG kayıt sistemine bağlanır ve bir pleksiglas odaya yerleştirilir. Nöbet oluşumunu izlemek için beyin aktivitesi kaydedilirken sıçanın serbestçe hareket etmesine izin verilir.

Epilepsiye Bağlı Sıçanlarda Epileptik Nöbetlerin Elektroensefalografik Kaydı

Kaynak: Soukupová, M.,  et al. Serbest hareket eden sıçanlarda EEG kayıtları sırasında uyarıcı amino asitlerin mikrodiyalizi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, kronik epilepsi indüksiyonu olan sıçanlarda hücre dışı uyarıcı nörotransmitter seviyelerinin değerlendirmesini göstermektedir. Beyne bir mikrodiyaliz probu implante ettikten ve elektroensefalografi (EEG) kullanılarak nöbet olmadığını doğruladıktan sonra, epileptik sıçanlarda yüksek nörotransmitter seviyelerini değerlendirmek için hücre dışı...

Kronik Epilepsi ile İndüklenen Sıçanlarda Uyarıcı Nörotransmitter Düzeylerinin Değerlendirilmesi

Kaynak: Jang, S., et al, Postsinaptik Yoğunluk Proteinlerinde Nöbet Kaynaklı Değişiklikleri İncelemek İçin Sıçanlarda Elektrokonvülsif Nöbetler ve Hipokampuslarının Fraksiyonlanması. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, nöbetin neden olduğu nöroplastisiteyi incelemek için bir sıçan modelinde akut elektrokonvülsif nöbetin (ECS) indüksiyonunu göstermektedir. Araştırmacılar, kulak klipsi elektrotları aracılığıyla elektriksel stimülasyon uygulayarak nöronal hipereksitabiliteyi ve klonusu tetikler. Bu...

Bir sıçan modelinde akut elektrokonvülsif nöbetin indüklenmesi

Bu video, noninvaziv koşullar altında belirli bir preklinik fokal epilepsi modeli ile sedasyonlu sıçanlarda yüksek çözünürlüklü EEG'nin hazırlanma, kayıt ve kaynak analizi prosedürlerini tanıtmaktadır.

Yüksek Çözünürlüklü EEG Kayıtlar kullanarak Odak Epilepsi Preklinik Rat Modelleri Beyin Kaynak Görüntüleme

Bu ayrıntılı protokolünü transkranyal uyarım elektrot yerleştirme temporal kemik üzerinde kısa ve uzun vadeli etkileri Transkraniyal elektriksel stimülasyon fareler serbestçe hareket araştırmak için açıklar.

Kronik Transkraniyal elektriksel stimülasyon ve Sıçanlarda Intracortical kayıt

4 aminopyridine uyarılan epileptiform aktivite kayıt ve elektrik modülasyon elektrot dizileri kullanma kemirgen beyin dilimler halinde gerçekleştirme göstermektedir. Özel kayıt odası doku canlılığı uzun süreli deneysel oturumları boyunca korur. Elektrot eşleme yaşamak ve uyarıcı çiftlerinin seçimi özel bir grafik kullanıcı arabirimi tarafından yapılmaktadır.

Kayıt ve modülasyon Epileptiform aktivite elektrot dizilerin birleştiğinde kemirgen beyin dilimleri içinde

Akut kriz modelleri epileptiform olaylar altında yatan mekanizmaları eğitim için önemlidir. Ayrıca, epileptiform olaylar üstünde-istek oluşturma yeteneği kendi başlatma altında yatan olay tam sırası çalışmaya son derece verimli bir yöntem sağlar. Burada, fare ve insan dokusu içinde kurulan akut 4-aminopyridine kortikal nöbet modelleri açıklar.

Akut Ictal faaliyet kemirgen ve insan dokusu üretimi ve isteğe bağlı başlatma

Burada, in vivo microdialysis EEG kayıtları ile birlikte epileptik ve sigara-epileptik sıçan ventral hipokampus glutamat ve aspartat sürümde analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ekstraselüler glutamat ve aspartat konsantrasyonu hastalık farklı aşamalarında ile ilişkili.

Microdialysis fareler serbestçe hareket EEG kayıtları sırasında eksitatör Amino asit

Epilepsi araştırmalarının zorluk klasik tedavinin yetersiz kaldığı hastalarda yeni tedaviler geliştirmektir. Yeni bir protokol kullanarak-implante edilmiş bir ilaç teslim sistemi yardımıyla-epileptik odak içine GABA elektroforetik teslim tarafından anestezik fareler nöbetleri kontrol edebiliyoruz.

, Γ-aminobutirik asit elektroforetik teslim (GABA) epileptik odaklama içine fareler nöbetleri önler

Sunulan protokol, potansiyel antiepileptik maddeler için bir preklinik değerlendirme aracı olarak hayati beyin dilimleri kullanmak nihai hedefi ile rezeke insan hipokampal doku taşıma ve hazırlanması açıklar.

Elektrofizyolojik Kayıtlar için Akut İnsan Hipokampal Dilimlerinin Hazırlanması

Bu yazıda, transgenik VGAT-Cre farelerinin elektriksel çıralarına dayanan temporal lob epilepsi modeli oluşturma yöntemleri açıklanmaktadır. Kindled VGAT-Cre fareleri, epilepsiye neyin neden olduğunu belirlemede ve yeni tedavileri taramada yararlı olabilir.

Temporal lob epilepsisi için bir model oluşturmak üzere elektriksel olarak çırılan VGAT-Cre fareleri için elektrotların hazırlanması ve implantasyonu

Öğrenin farelerde elektrokonvulsif nöbet indüksiyonu ve hipokampal fraksiyonasyon yöntemini. Bu teknik, postsinaptik yoğunluktaki protein değişikliklerini inceleyerek nöroplastisite mekanizmalarını araştırmanıza olanak tanır.

Elektrokonvulsif nöbetler fareler ve onların Hippocampi ayırma nöbet kaynaklı değişiklikleri postsinaptik yoğunluğu proteinlerde incelemek için (Video) | JoVE Journal

Elektrokonvulsif nöbetler fareler ve onların Hippocampi ayırma nöbet kaynaklı değişiklikleri postsinaptik yoğunluğu proteinlerde incelemek için

Daha fazla video keşfet