Elektrokonvulsif nöbetler fareler ve onların Hippocampi ayırma nöbet kaynaklı değişiklikleri postsinaptik yoğunluğu proteinlerde incelemek için

Elektrokonvulsif nöbet (ECS) Elektrokonvulsif terapi şiddetli depresyon için bir deneysel hayvan modeldir. ECS synaptogenesis ve sinaptik plastisite yol hipokampüs, faaliyet genel olarak uyarır. Burada, ECS indüksiyon Sıçanlarda nöbet kaynaklı sinaptik protein değişimler incelemek için kendi hippocampi hücre altı ayırma yöntemleri açıklanmaktadır.

Elektrokonvülktif nöbet indüksiyonunun ve ardından hipokampusun küçük ölçekli fraksiyonasyonunun genel amacı, sıçan beyninde küresel nöbet aktivitesini indüklemek ve hipokampusun postsinaptik yoğunluğunda nöbet aktivitesinin neden olduğu protein değişikliklerini incelemektir. Bu yöntem, filmin nöral sürecinde, nöbet sırasında belirli beyin bölgelerinde hangi snaptic proteinlerin düzenlendiği ve bu tür bir düzenlemenin nöroplastisiteye katkıda bulunup bulunamayacağı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu elektrokonvülsif nöbet indüksiyon protokolünün ana avantajı, nöronal ölüm olmadan law-dons beyin aktivitesinin lo-bal alivansını canlı olarak indükleyebilmemizdir.

Prosedürü göstermek ben ve Dr.Hee Jung Chung'un laboratuvarından Han Gil Jeong olacak. Bu işleme başlamak için, bir erkek fareyi kapaklı temiz, boş bir kafese yerleştirin. Farenin 30 dakika alışmasına izin verin, ardından nabız üretecini ECS indüksiyonu için ayarlayın.

Sıfırlama düğmesine basarak darbe üretecini hazırlayın ve hazır düğmesinin yandığından emin olun. Kulak klipslerinin darbe üretecine takılı olmadığından emin olun. Ardından, şok düğmesine birkaç saniye basın, ardından kulak klipslerini nabız üretecine takın.

Bu adımda, kulak klipslerini steril tuzlu su ile ıslatın ve doymuş olduklarından emin olun. Daha sonra, farenin kulaklarını tuzlu suya batırılmış gazlı bezle sararak steril tuzlu su ile ıslatın. Islandıklarında gazlı bezi çıkarın.

Klipsleri kulak başına bir klips olacak şekilde kulaklara takın ve ana kıkırdak bandının ötesine yerleştirin. Şok düğmesine birkaç saniye basın ve nöbeti gözlemleyin. Sahte için, nöbet kontrolü yok, fareye aynı şekilde davranın, ancak akımı vermeyin.

Klonus başladığında, kulak klipslerini çıkarın ve nöbet davranışını gözden geçirilmiş, bir ila beş arasında bir Racine ölçeğine göre kaydedin. Bu, dördüncü aşamada dört uzuv klonusu ile yetiştirmeyi ve beşinci aşamada dört uzuv klonusu ile yetiştirmeyi ve düşmeyi içerir. Nöbet yaklaşık 10 saniye sürmelidir.

Bir zamanlayıcı kullanarak nöbet süresini kaydedin. Nöbet sona erdikten sonra, fareyi ev kafesine geri koyun. Nöbetlerden kurtulduğundan emin olmak için fareyi beş dakika daha izleyin.

Kafeste tek başına tutun ve kafesi uyanma odasına geri koyun. Bu prosedürde, bir sıçandan iki hipokampusu 30 milometrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin ve makas kullanarak küçük parçalar halinde kıyın. Bundan sonra, kıyılmış hipokampusu manuel bir cam homojenizatöre aktarın ve bir mililitre buzlu soğuk homojenizasyon tamponu ekleyin.

Ardından, bir cam homojenizatöre yuvarlak bir pecil yerleştirin. Cam homojenizatör buz üzerindeyken, küçük hipokampal doku parçaları kaybolana kadar bir dakika boyunca 10 ila 15 kez pecil üzerinde nazikçe ve sabit bir şekilde yukarı ve aşağı hareket ettirin. Daha sonra, homojenliği bir milometrelik bir pipet kullanarak 1.7 milometrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve nükleer sonrası süpernatanı çözünmeyen doku ve çekirdek içeren peletten ayırmak için homojeni dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra 50 mikrolitre ve 950 mikrolitre S1 fraksiyonunu iki ayrı yeni 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve bu tüpleri buz üzerinde saklayın. Ayrıca, P1 fraksiyon peletini buz üzerinde saklayın. Daha sonra, sitozolik çözünür proteinlerle zenginleştirilmiş süpernatanı ve sinaptozomal proteinler de dahil olmak üzere zara bağlı proteinlerle zenginleştirilmiş peleti ayırmak için 950 mikrolitre S1 fraksiyonunu 13, 800 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika

S2 fraksiyonunu yeni bir 1.7 mililitrelik mikrosantrifüje aktarın ve buz üzerinde saklayın. Bunu takiben, P2 fraksiyon peletini 498 mikrolitre buz gibi soğuk arıtılmış suda yeniden süspanse edin. Dört milimolar topuktan oluşan bir son konsantrasyon elde etmek için iki mikrolitre bir molar topuk ekleyin.

Süspansiyonu 30 dakika boyunca çalkalama ile dört santigrat derecede inkübe edin. 30 dakika sonra, yeniden askıya alınmış P2 fraksiyonunu buz üzerinde saklayın. Bu adımda, parçalanmış süpernatanı ve parçalanmış peleti ayırmak için P2 fraksiyonunu 25.000 kez G ve dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin.

LS2 fraksiyonunu yeni bir 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde saklayın. Ardından, LP1 peletini 50 milimolar topukta 250 mikrolitre halinde yeniden süspanse edin, 250 mikrolitre yüzde bir deterjan ve 1 X PBS ile karıştırın. Süspansiyonu 15 dakika boyunca hafif çalkalama ile dört santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, PSD olmayan fraksiyon süpernatanı PSD fraksiyon peletinden ayırmak için yeniden askıya alınmış LP1 peletini 25.000 kez G ve dört santigrat derecede 3 saat santrifüjleyin. Süpernatanı 1.7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne çıkarın ve PSD peletini 100 mikrolitre 50 milimolar topuklar halinde yeniden süspanse edin. Bu şekilde, temsili batı lekeleri, sahte hipokampustan S2, P2 ve PSD fraksiyonlarında NMDA alıcı alt birimi GluN2B, ampa reseptörü, GluA2 ve STEP 61'in protein ekspresyonunu, nöbet geçirmeyen sıçanları ve akut ECS alan sıçanları göstermektedir.

Sitoplazmik çözünür protein alfa-Tubulin, S2 fraksiyonunda zenginleştirilmiştir. Sinaptofizin bir presinaptik vezikül proteinidir ve ham zar P2 fraksiyonunda zenginleştirilir, ancak PSD fraksiyonunda zenginleştirilmezken, PSD-95 hem P2 hem de PSD fraksiyonlarında zenginleştirilir. Burada, akut ECS'den üç ve 24 saat sonra P2 ve PSD fraksiyonlarında GluN2B ve GluA2'nin miktar tayini gösterilmiştir.

P2 fraksiyonundaki GluN2B ve GluA2 ekspresyonu, S2 fraksiyonunda alfa-Tubuline normalize edildi. PSD fraksiyonunda GluN2B ve GluA2 ekspresyonu, PSD fraksiyonunda PSD 95'e normalize edildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş ila altı saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, ECS tarafından başka hangi sinaptik proteinlerin değiştirildiği gibi ek soruları yanıtlamak için protein karışımına dayalı kütle, spector-metri gibi oto-masser gerçekleştirilebilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra, nörolojik hastalıklar alanındaki araştırmacıların, nörolojik hastalıkların trans-gen-ing motorları olan kanun yapıcılar için sinaptik disfonksiyonun altında yatan mekanizmayı keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, yasalarda ECS'yi nasıl indükleyeceğinizi, hipokampustan homojenizasyonu ve PSD fraksiyonasyonunu nasıl yapacağınızı ve ECS sonrası sinaptik proteinlerdeki değişiklikleri nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.