Düzensiz Nanopatterns Dendrimer tabanlı yerel olarak kumanda yüzeyi Adhesiveness için: Chondrogenic farklılaşma yönlendirmek için bir yöntem

Bu protokolün genel amacı, yerel yüzey yapışkanlığının nano ölçekli kontrolüne izin veren büyük ölçekli dendrimer bazlı düzensiz nanodesenler elde etmektir. Açıklanan yöntem, hücre yapışması ve kondrojenik farklılaşma çalışması için uygulanır. Dendrimer yükseltilmiş nanodesenler, nano ölçekte yüzey yapışkanlığını yerel olarak kontrol etmeye izin verir.

Nanodesenler oluşturmak için hücre yapıştırıcısı RGD peptidi ile modifiye edilmiş birinci nesil polinanomerler kullanılır. Mikroskopi tekniklerine göre tarama ile karakterize edilirler ve hücre yapışması ve farklılaşma çalışmalarında kullanılırlar. Daha sonra mikroskopi ve immün boyama tekniklerinden elde edilen sonuçları analiz ediyoruz.

İlk adım, çalışma alt tabakalarını hazırlamaktır. Özelleştirilmiş kare cam slaytlar, mikroskopi slaytlarının elmas uçlu bir kesici ile kesilmesiyle üretilir. 1,25 x 1,25 santimetre boyutunda slaytlar yapın.

Slaytları deiyonize su, ardından %96 etanol ile yıkayın ve kurumaya bırakın. Bir basınç tüpüne 200 miligram PLLA ekleyerek %2'lik PLLA çözeltisini hazırlayın ve 10 mililitre dioksan ekleyin. Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve tüpü sıkıca kapatın.

Karışımı, hafifçe karıştırarak 24 saat boyunca 60 santigrat derecede bir gliserin banyosunda ısıtın. Cam slaytları, PLLA solüsyonunu içeren bir cam şişeye, 60 santigrat derecede temiz, sıcak bir plaka üzerine yerleştirin. Gerekli sıcaklığa ulaşmak için en az 10 dakika bekleyin.

Cam slaytı sıkma kaplayıcı aşamasına yerleştirerek ve seçilen programı çalıştırarak cam alt tabakaları PLLA çözeltisi ile sıkarak kaplayın. Homojen bir kaplama sağlamak için saniyede 300 rpm'de beş saniyede 500 rpm'lik bir ön adım ile saniyede 1.500 rpm'lik bir ivme ile 30 saniye boyunca 3.000 rpm seçiyoruz. Spin kaplı camlar buzdolabında saklanabilir.

Deiyonize suda mililitre başına 0.77 miligram RGD-Cys-D1 dendrimer çözeltisi olan 10 dakikalık çözelti A için hazırlayın ve sonikleştirin. Daha sonra deiyonize suda sırasıyla %10 ila %2 ve %10 ila %5'lik B ve C dendrimer çözeltileri hazırlayın. Çözelti C'yi 10 dakika boyunca sonikate edin ve aşağıdaki dendrimer çözeltilerini, D, E ve F'yi de deiyonize suda hazırlayın.

Çözelti D, 2,5x10 ila %8 çözeltisi E, 10 ila %8 ve çözelti F, 4 10 üzeri %9Bu çözeltileri kullanana kadar buzdolabında saklayın. Hücre kültürü kabininin UV lambası ile 18 PLLA kaplı camları steril hale getirmek için 13 dakika boyunca mezun oluyorsunuz. Dendrimer çözeltilerinin her birini 10 dakika boyunca sonikleştirin.

Dendrimer çözeltilerini, hücre kültürü kabini laminer akışı altında 12 oyuklu bir plakada PLLA kaplı cam kızaklar üzerindeki 0.22 mikrometre çapındaki filtrelerden süzün. Oda sıcaklığında 16 saat kabin içinde bırakın ve steril, deiyonize su ile yıkayın. Pozitif kontrol numuneleri için, PBS'de steril bir fibronektin çözeltisi hazırlayın ve replikaları çözelti ile hücre kültürü kabininde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Onları PBS ile yıkayın. Kalan üç PLLA kaplı alt tabaka, negatif kontrol için kopyalar olarak işlev görecektir. Nanodesen topografyası, havada kılavuz çekme modunda çalıştırılan AFM ile analiz edilir.

AFM uç tutucusuna metre başına 40 Newton yay sabiti ve rezonans frekansı 300 kilohertz olan bir silikon konsol monte edin. Nanodesen substratı AFM aşamasındayken, temas edene kadar yüzeye yaklaşın ve yüzeye aşırı basınç uygulamadan dendrimer konfigürasyonunun görüntülenmesine izin veren bir genlik ayar noktası seçin. Koşul başına üç bağımsız alt tabakanın alt tabakası başına 5x5 mikrometrelik en az üç temsili görüntü kaydedin.

Elde edilen görüntüleri AFM işleme yazılımı ile işleyin. İşlenmiş AFM yükseklik görüntülerinde dendrimerleri seçin ve karşılık gelen görüntü eşiklerini elde edin. Parçacık hassasiyetlerini elde edin ve bunları minimum parçacıklar arası mesafeleri elde etmek için kullanın.

Minimum parçacıklar arası mesafeler için olasılık kontrol tapalarını elde etmek için Z'deki minimum parçacıklar arası mesafeleri karşılık gelen parçacık hassasiyetlerine bırakın. Yerel RGD yüzey yoğunluğunun 70 nanometrenin altında olduğu bölgeleri görselleştirmek için grafiğin renk ölçeğini ayarlayın. Bu bölgelerin alanını, görüntüde seçerek ve bir eşik oluşturarak ölçün.

Erken pasajlardan, tercihen beşin altındaki mezenkimal kök hücrelerden elde edilen ticari insan yağını kullanın. Kök hücre büyüme ortamında 37 derece ve %4.6 CO2 atmosferinde %70 veya %80 birleşme noktasına ulaşana kadar kültürleyin. Hücreleri, kondrogenezi indükleyen bir ortamdaki substratlar üzerinde santimetre kare başına 3.000 hücre yoğunluğunda tohumlayın.

Ortamı her üç günde bir değiştirin. Yoğunlaşma aşaması kültürdeki ilk günden itibaren gözlemlenebilir ve evrimleri tüm kültür laboratuvarları sırasında bir optik faz kontrast mikroskobu ile takip edilebilir. Hücreleri oda sıcaklığında% 10 formalin çözeltisi ile 20 dakika sabitleyin ve ardından PBS ile yıkayın.

PBS'ye 50 milimolar bir amonyum klorür çözeltisi ekleyerek furaldehit gruplarını kilitleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika bekletin. PBS ile yıkayın.

Hücreleri, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de% 1 albüminin bloke edici çözeltisinde% 0.1'lik saponin çözeltisi ile geçirgen hale getirin. Bloke edici çözeltideki primer antikorlarla oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. PBS ile yıkayın.

Işığa maruz kalmaktan kaçınarak, bloke edici çözeltideki ikincil antikorlarla oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. PBS ile yıkayın ve kurulayın. Numunelerin üzerine mikroskopi montaj ortamı uygulayın ve üzerlerini lamel ile nazikçe örtün.

Bir günlük kondrojenik indüksiyondan sonra fokal adezyon proteini paxillin için immün boyalı numuneleri ve dik konfokal mikroskop kullanarak beş günlük kondrojenik indüksiyondan sonra erken kondrojenik belirteç kollajen II alfa I için görüntüleyin. Bölümleri temsili bir aralıkta, örneğin 0,5 veya 1 mikrometre toplayın. Hücre kondensatlarının bazal bölgesinden paxillin için boyanmış görüntüleri filtreleyin.

Arka planı kaldırın, düzeltin ve sekiz bitlik dosyalara dönüştürün. Ampirik olarak seçilmiş bir eşik ayarlayarak bunları ikili hale getirin. Üç bağımsız numunenin koşulu başına en az üç hücre kondensatını tedavi edin.

Seçilen alanları ölçün ve bunları, görüntüdeki hücre çekirdeği sayısına bölünen karşılık gelen alan yüzdesi olarak ifade edin. Kollajen II alfa I boyamasını ölçmek için konfokal Z projeksiyonları oluşturun. Ortaya çıkan görüntüleri filtreleyin, arka planı kaldırın, düzeltin ve bir eşik ayarlayın.

Numune başına öngörülen maksimum kollajen II alfa I alanının toplamını, karşılık gelen hücre kondensatının alanına karşı ölçün. Çözeltideki ilk dendrimer konsantrasyonunu değiştirerek farklı nanomodel konfigürasyonları elde edilebilir. Nanodesenler, oluşturulan minimum parçacıklar arası mesafe için AFM analizi ve olasılık kontur grafikleri ile görselleştirilebilir.

Yüzeydeki en yüksek yerel RGD yüzey yoğunluğuna sahip bölgeleri vurgularlar. Dendrimer nanodesenleri, hücre yapışma çalışmalarında kullanılır. Lokal RGD yüzey yoğunluğu ile yapışma artar.

Pozitif kontrol ve dendrimer agregaları içeren yüzeyler için bu korelasyon kaybolur. Lokal RGD yüzey yoğunluğunun etkisi kondrogenezde test edilmiştir, hem hücre yoğunlaşması hem de farklılaşması, bir ara yapışkanlık sunan nanodesenler tarafından tercih edilir. Sonuç olarak, yerel RGD yoğunluğunun hücre yanıtı üzerindeki etkisini ele almak için üç tablolu bir yöntemde dendrimer bazlı nanomodel.

Nanodesenler, hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan karşılık gelen homojen yüzeyde hücre yapışmasını daha verimli bir şekilde sürdürür. Farklılaşma deneylerinde, hücrelerin substrata ara yapışkanlığı, mezenkimal hücre yoğunlaşmasını ve erken kronojenik farklılaşmayı destekledi. Dendrimer periferik büyümesinin kolay modifikasyonu nedeniyle, burada açıklanan yöntem, hücreler üzerinde yoğunluk etkisi olan tüm aşırı romatizmal tabakalara daha da genişletilebilir.