Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi Drosophila

Drosophila'nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır.

Bu prosedürün genel amacı, apoptotik hücre yutulmasında ilgilenilen spesifik genlerin katılımını değerlendirmek için Drosophila'da in vivo fagositozu ölçmektir. Bu yöntem, immünoloji ve gelişim biyolojisi alanlarındaki apoptotik hücre yutulmasında rol oynayan mekanizmalar hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücrelerin in vivo fagositoz seviyelerinin kolayca ve hassas bir şekilde ölçülebilmesidir.

Bu tekniğin anlamı, iltihaplanmaya neden olan tehlikeli hücrelerin uzaklaştırılması için fagositoz ile apoptotik hücre gerektiğinden, enflamatuar bozuklukların ve otoimmün hastalıkların tedavisine kadar uzanır. 50 mililitrelik konik bir tüpe 200 yetişkin dişi ve 200 yetişkin erkek meyve sineği ve maya üzerine bir tabak taze üzüm suyu agar ekleyerek başlayın. Tüpü bir sünger kapakla kapatın ve sinekleri iki ila üç gün boyunca 16 santigrat derecede ışıkta inkübe edin.

Kuluçka süresinin sonunda, sinekleri karanlıkta bir saat boyunca 25 santigrat dereceye getirin ve eski plakayı mayasız yeni bir plaka ile değiştirin. Sineklerin iki saat boyunca yumurta bırakmasına izin verin. Daha sonra plakayı 26 saat boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, embriyoları %0.2 Triton X-100 ile takviye edilmiş bir mililitre PBS'ye aktarmak için bir boya fırçası kullanın. İki yıkamadan sonra, koryonu çıkarmak için embriyolara 1.2 mililitre sodyum hipoklorit çözeltisi ekleyin. Üç dakika sonra, embriyoları taze PBS artı Triton X-100'de dört kez yıkayın.

Yıkanmış embriyoları altı santimetrelik bir agaroz plakasına aktarın ve plakayı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Bir mikro uç kullanarak evre 16 embriyolarını tanımlayın. Evre 16 embriyolarının yaklaşık 50'sini 1.5 mililitrelik bir mikro test tüpüne aktarmak için bir mikro pipet kullanın.

Embriyonik hücreleri izole etmek için önce embriyoları 150 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın. Embriyoları 1.5 mililitrelik yeni bir mikro test tüpüne aktarın. Daha sonra 200 mikrolitre kollajenaz ekleyin ve embriyoları bir pelet karıştırıcı ile 30 kez homojenize edin.

Homojenizasyonun sonunda, embriyonik hücreleri 10 kez ezin ve hücre süspansiyonunu yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Hücreleri bir dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra hücreleri 10 kez daha ezin ve bir dakika daha 37 santigrat derece inkübatöre geri koyun.

İkinci inkübasyonun sonunda, hücrelere 800 mikrolitre PBS ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzmeden önce peleti 200 mikrolitre Tripsin içinde yeniden süspanse edin. 800 mikrolitre PBS'de 40 mikrolitre ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ile enzimatik aktiviteyi durdurun ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.

Çökelmiş hücreleri 200 mikrolitre taze PBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın. Peletleri 30 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri aminopropiltrietoksisilan kaplı bir cam slayt üzerine monte edin. Hücreler takıldığında, slayttan fazla PBS'yi çıkarmak için bir pipet kullanın ve hücreleri 60 ila 70 mikrolitre% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.

10 ila 15 dakika sonra, sabitleyiciyi çıkarın ve hücreleri PBS'de bir dakika boyunca yıkayın. Hücreleri anti-Croquemort antikoru ile immün boyamak için, önce slaytı seri olarak metanole batırın, ardından PBS% 0.2 Triton X-100 ile takviye edilmiş PBS'yi ve ardından tek başına PBS'yi izleyin. Daha sonra, PBS'de 20 mikrolitre% 5 tam domuz serumu ve% 0.2 Triton X-100 ile oda sıcaklığında 20 dakika boyunca spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.

Fazla bloke edici solüsyonu çıkarın ve hücreleri gece boyunca dört santigrat derecede 20 mikrolitre anti-Croquemort antiserum ile etiketleyin. Ertesi sabah, slaytı PBS artı Triton X-100'de beş adet 10 dakikalık inkübasyon için yıkayın. Son yıkamadan sonra, slaytı PBS'de 10 dakika durulayın.

Daha sonra hücreleri bir saat boyunca oda sıcaklığında 20 mikrolitre alkalin fosfataz etiketli Anti-Rat IgG ile etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, slaytı gösterildiği gibi PBS artı Triton X-100'de beş kez yıkayın ve ardından tampon solüsyonunda 10 dakika bekletin. Daha sonra hücreleri fosfataz substrat çözeltisi ile etiketleyin ve hücreleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin.

Hemosit granüllerinde güçlü mor sinyaller göründüğünde, fazla substratı çıkarın ve slaytı beş ila 10 dakika boyunca EDTA ile desteklenmiş tamponda bekletin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri iki adet beş dakikalık PBS yıkama ile durulayın ve 10 dakika boyunca dengeleme tamponu ile muamele edin. Çözeltiyi çıkardıktan sonra, hücreleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede 20 mikrolitre terminal deoksinükleotidil transferaz çözeltisi ile etiketleyin.

Daha sonra çözeltiyi slayttan çıkarın ve hücreleri 0,5 mililitre içinde bekletin, yıkama tamponunu 17 mililitre suda 10 dakika bekletin. Daha sonra, hücreleri üç adet beş dakikalık PBS yıkama ile durulayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 20 mikrolitre anti-digoksigenin peroksidaz ile etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri gösterildiği gibi PBS'de dört kez yıkayın ve apoptotik hücreler kahverengiye dönene kadar slaytı peroksidaz substratında 30 saniyelik artışlarla bekletin.

Optimal bir boyama elde edildiğinde, peroksidaz reaksiyonunu durdurmak için slaytı suya batırın. Bu görüntülerde, hemosit adı verilen Drosophila makrofajları, hemosit belirteci Croquemort ve az önce gösterildiği gibi dağınık embriyonik hücrelerde TUNEL tarafından fagositozlu apoptotik hücrelerin varlığı için boyandı. Croquemort pozitif hücreler, hücrelerinin küçük granüllerinde mor sinyaller sergilerken, TUNEL pozitif hücreler tüm gövdelerinde kahverengi sinyal gösterdi.

Alternatif olarak, hemositler sadece granüller yerine tüm hemositi boyayan bir anti-GFP antikoru ile boyanabilir. Bu deneyde, vahşi tip veya tek mutant embriyolarda fagosite eden hemositlerin toplam hemositlere oranı analiz edildi ve fagositik indeksin her iki tek mutant suşta da vahşi tip sineklere göre daha düşük olduğunu, toplam hemosit ve apoptotik hücre sayısının ise benzer olduğunu gösterdi. Tek genlerin RNAi yıkımı aynı zamanda fagositik indeksi azaltırken, toplam hemosit ve apoptotik hücre sayısı karşılaştırılabilir kalırken, araştırılan fagositoz reseptörlerinin apoptotik hücre aracılı fagositoza katılımını daha da vurgulamaktadır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa yaklaşık 15 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, hücrelerin fagositotik yeteneğinin optimal değerlendirmesi için aşırı hemosit markörü ve TUNEL boyamasından kaçınmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, tüm Drosophila embriyolarının in situ fagositoz testi, yutulma yeri veya hemositlerin dağılımı hakkında ek soruları yanıtlamak için yapılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların Drosophila'daki apoptotik hücre yutulması mekanizmalarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, Drosophila embriyolarında in vivo fagositozun nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.