4.7: Endositoz ve Ekzositoza Giriş

Endositik ve ekzositik yollar, hücresel homeostaz, doku fonksiyonu ve genel hücre sağkalımı için kritik öneme sahiptir. Basitçe söylemek gerekirse, endositoz, bir hücrenin, zarını etrafına katlayarak ve bir vezikül oluşturarak hücre dışı boşluktan molekülleri almak için kullandığı süreçtir. Ekzositoz, maddeleri hücre dışı boşluğa salmak için vezikülleri kullanan ters işlemdir. Bu süreçlerin hormon sekresyonu, membran reseptörü içselleştirmesi, patojen yutulması ve nöronal iletişimde kritik bir rol oynadığı öne sürülmüştür.

Bugün, endositoz ve ekzositoz alanındaki dönüm noktası niteliğindeki keşiflerin bazılarının izini süreceğiz, cevaplanmamış bazı soruları vurgulayacağız, bugün kullanılan dikkate değer yöntemleri öne çıkaracağız ve son olarak, bu süreçleri daha iyi anlamak için gerçekleştirilen birkaç özel deneyi keşfedeceğiz.

Mevcut endositoz ve ekzositoz anlayışına yol açan bazı önemli keşifleri tekrar gözden geçirelim.

Endositoz ile ilgili ilk dokümantasyon, Ilya Metchnikov'un bir ışık mikroskobu kullanarak, belirli hücrelerin istilacı patojenleri yuttuğunu gözlemlediği 1882 yılına kadar haritalanabilir. Bu süreci, hücrelerin vezikül oluşumu yoluyla patojeni yuttuğu "fagositoz" olarak adlandırdı. Neredeyse yarım yüzyıl sonra, 1931'de Warren Lewis, hücreler sıvı aldığında benzer bir vezikül oluşumu sürecini gözlemledi. Bu davranışa "pinositoz" adını verdi.

Daha sonra 1953'te George Palade, hücrenin yapısal ve işlevsel organizasyonunu incelerken, zarların "mağara benzeri" istilalarını keşfetti ve onlara caveolae adını verdi. Bunların hücre alımı için gerekli olması gerektiği sonucuna vardı. Kısa bir süre sonra, 1955'te Nobel ödüllü Christian de Duve, "fagositoz" ve "pinositoz" u kapsayan endositoz terimini icat etti. Ancak, endositoz hikayesi henüz bitmemişti.

1975 yılında, elektron mikroskobu uzmanı Richard Anderson ile Michael Brown ve Joseph Goldstein, düşük yoğunluklu lipoprotein veya LDL'nin hücre yüzeyi reseptörüne bağlandığında "kaplanmış çukurlar" oluşumuna yol açtığını gözlemledi. Bu çukurlar daha sonra içselleştirilir ve LDL reseptörleri endositozlanır. Bu, "reseptör aracılı endositoz" adı verilen üçüncü tipin keşfiydi. Aynı yıl, Barbara Pearse, bir triskelion molekülü olan ana kaplama proteinini izole etti ve ona klatrin adını verdi. Bu nedenle, bu süreç aynı zamanda "klatrin aracılı endositoz" olarak da adlandırılır.

Hepsi endositoz ile ilgiliydi. Şimdi ekzositoz hakkında nasıl bilgi edindiğimizi tartışalım. 1980 yılında, Randy Schekman'ın grubu, salgı eksikliği olan maya mutantları üretti ve ekzositoz için gerekli proteinleri kodlayan kritik genlerin varlığını ortaya çıkardı.

1993 yılında James Rothman bu proteinlerden bazılarını tanımladı ve kimyasal yapılarına dayanarak SNARE olarak adlandırıldı. Ufuk açıcı "SNARE hipotezi" nde, bu sarmal yapıların birbirine yapıştığını ve zarların kaynaşmak ve ekzositoz oluşturmak için yeterli kuvvetle yaklaşmasına neden olduğunu öne sürdü.

Aynı zamanda, Thomas Südhof, bu sürecin, nörotransmitter salınımı için vezikül füzyonunu teşvik eden ve doğru bir şekilde zamanlayan sinaptotagminler adı verilen kalsiyum algılayıcı proteinler tarafından nöronlarda da sıkı bir şekilde kontrol edildiğini tespit etti. Birlikte, bu bilim adamları 2013 yılında Nobel Ödülü'ne layık görüldü.

Bu keşiflerin genişliğine rağmen, birçok ilgi çekici bulmaca devam ediyor. Bugün araştırılan bazı sorulara bir göz atalım.

Bilim adamları, endositoz ve ekzositoz işlevlerinin madde edinme ve salgılamanın ötesine nasıl geçtiğini sormaya başlıyorlar. Örneğin, nörotransmiterler, hücre boyutunda feci bir genişleme olmadan hücre zarına kaynaşan veziküller tarafından sürekli olarak nasıl salınır? Genişlemeyi dengelemek ve kaynakları geri dönüştürmek için hücrelerin zarı içselleştirmesine neden olan sinyalleri belirlemeye çalışıyorlar.

Bir başka ilginç konu da şu: Bu süreçleri yönlendiren karmaşık moleküler makineyi hangi bileşenler oluşturuyor? Örneğin, fagositoz, istilacı patojenleri çevrelemek için büyük zar deformasyonları gerektirir. Bilim adamları, aktin gibi hücre iskeleti proteinlerinin dramatik zar yeniden şekillenmesine nasıl katkıda bulunduğunu araştırıyorlar.

Son olarak, anormal endositoz ve ekzositoz ciddi hastalıklara yol açabileceğinden, bilim adamları bu düzensizliğe neyin neden olduğunu anlamakla ilgileniyorlar. İncelenen proteinlerden biri, nöronlardan salgılanması yakındaki nöronların ilerleyici ölümünde rol oynayan α-sinükleindir. Ekzositozunu anlamak, Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıkların tedavisi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.

Artık araştırılan bazı temel soruları göz önünde bulundurduğumuza göre, bunları yanıtlamak için hangi araçların mevcut olduğunu görelim.

Araştırmacılar, hücre yüzey proteinlerinin endositozunu izlemek için bir hücre biyotinilasyon testi kullanırlar. Bu işlem, bir yüzey proteininin floresan etiketli biyotin ile etiketlenmesini ve ardından hücrenin endositoza uğramasına izin verilmesini içerir. Bunu, protein içselleştirmesini ortaya çıkaran immün leke analizi takip edebilir.

Nöronal vezikül geri dönüşümünü ölçmek için, birçok bilim adamı hücreleri FM boyaları gibi zara özgü floresan moleküllerle etiketler. Bu boyalar dış broşüre stabil bir şekilde bağlanır ve sadece endositoz ile içselleştirilir. Sıralı stimülasyonu takiben ekzositoza uğrarlar. Salınımı bir floresan mikroskobu ile analiz etmek, tüm geri dönüşüm süreci hakkında daha derin bir bilgi sağlar.

Genellikle, ekzositoza izin veren bileşenlerin katkılarını manipüle etmek ve anlamak için, bilim adamları füzyon tahlilleri kurarlar. Farklı floresan boya içeriklerine sahip iki set vezikül hazırlanır ve bir araya gelmesine izin verilir. Aralarındaki füzyon, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak izlenebilen yeni bir ürünün oluşmasına neden olur.

Son olarak, floresan görüntüleme ve floresan canlı hücre görüntüleme dahil olmak üzere gelişmiş görüntüleme yöntemleri, araştırmacılara endositoz ve ekzositozun morfolojik yapılarını ve moleküler olaylarını görüntülemek için eşsiz bir fırsat sunar.

Son olarak, bilim adamlarının bu araçları bugün laboratuvarlarda uyguladıkları bazı özel yollara bakalım.

Hücre biyologları, ekzositozun yaralı zarların iyileşmesine nasıl yardımcı olduğunu incelemekle ilgileniyorlar. Burada, araştırmacılar ilk olarak FM boyalarının çözeltisindeki hücreleri, üzerlerine cam boncuklar sararak yaraladılar. Daha sonraki floresan görüntüleme, ekzositoz hızının hızlı olması durumunda, zarı hızlı bir şekilde kapatacağını ve FM'nin hücreye sızmasını durduracağını göstermektedir. Ekzositoz yavaş olduğunda, geniş hücre içi FM boyaması ile sonuçlanır.

Araştırmacılar, spesifik füzyon proteinlerinin katkısını modellemek için füzyon tahlillerini kullanabilirler. Burada araştırmacılar, iki hücre havuzunun yüzeyinde SNARE proteinleri olan farklı vezikülle ilişkili zar proteinlerini veya "VAMP'ları" ifade ettiler. Daha sonra füzyonun gerçekleşmesine izin verildi ve sonuç bir spektrometre kullanılarak ölçüldü. Bu kurulumu kullanarak, bilim adamları birden fazla VAMP'ın füzyon verimliliklerini karşılaştırabildiler.

Son olarak, araştırmacılar bir ilaca yanıt olarak hücre yüzeyi reseptörü endositozunu anlamayı hedefliyorlar. Burada, bilim adamları floresanla etiketlenmiş hücreleri bir ilaçla tedavi ettiler ve hızlandırılmış mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı olarak gerçekleşen reseptör ilaçlı endositozu görselleştirdiler.

JoVE'nin endositoz ve ekzositozla tanışmasını az önce izlediniz. Bu videoda, fagositozun keşfinden nörotransmitter salınım mekanizmalarının tanımlanmasına kadar olan tarihsel olayları gözden geçirdik. Ardından, sorulan birkaç önemli soruyu tanıttık. Ayrıca öne çıkan araştırma stratejilerini araştırdık ve mevcut uygulamalarından bazılarını tartıştık. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!