Trans-Tympanic ilaç dağıtım ototoksisite tedavisi için

Biz bir teknik trans-tympanic rota üzerinden uyuşturucu yerelleştirilmiş yönetim koklea içine için mevcut. Bu rota üzerinden ilaç dağıtım gibi sisplatin kemoterapi ilaçların anti-kanser etkinliği ile müdahale olmaz.

Bu trans-timpanik prosedürün genel amacı, işitme kaybının tedavisi için yüksek konsantrasyonlarda antioksidanları, otoprotektif ajanları veya biyolojik reaktifleri lokal olarak doğrudan kokleaya vermektir. Trans-timpanik ilaç verme yolu, sistemik olarak uygulandığında önemli yan etkilere neden olabilecek ilaçların ve diğer ajanların kokleaya lokalize olarak verilmesine izin verir. Bu maddenin temel avantajı, ilaçların koklea içine sistemik uygulama ile elde edilenden önemli ölçüde daha yüksek dozlarda hızlı bir şekilde uygulanmasına izin vermesidir.

Bu teknik, anti-tümör etkisine müdahale etmeden sisplatin kaynaklı işitme kaybını önlemek için reaktiflerin profilaktik olarak verilmesi potansiyeline sahiptir. Ayak parmağını çimdiklemeye yanıt vermediğini onayladıktan sonra, farenin gözlerine merhem sürün. İşitsel beyin sapı tepkisini değerlendirmek için, fareyi kontrollü bir akustik kabinin içindeki 37 santigrat derecelik bir ısıtma yastığına yüzüstü pozisyonda yerleştirin ve arka tarafa paslanmaz çelik bir toprak elektrodu, kafatasının üst kısmına paslanmaz çelik pozitif bir elektrot yerleştirin. kulaklar arasında, ve her kulağın kulak kepçesinin altına bir paslanmaz çelik negatif elektrot.

Yüksek frekanslı dönüştürücü tüplerini farenin kulaklarına dikkatlice yerleştirin. Ardından, yüksek frekanslı dönüştürücüler kullanarak, akustik uyaranları 8, 16 ve 32 kilohertz'de beş milisaniyelik bir ton patlaması olarak uygulayın. Hayvanı sol lateral dekübit pozisyonuna getirin.

Kulak kanalına 2,5 milimetre tek kullanımlık bir kulak spekulumu yerleştirin ve spekulumu kulak zarı görünecek şekilde konumlandırmak için cerrahi bir dürbün kullanın. İğneleri, kulak zarı hala görünür olacak şekilde yönlendirmek önemlidir, çünkü kulak spekulumu çok küçüktür ve başarılı bir enjeksiyon, tüm materyallerin ve dokunun mikroskop altında görselleştirilmesini gerektirir. 29 buçuk gauge 0.5 mililitrelik bir insülin şırıngası kullanarak, 50 mikrolitre ilacı veya ilgilenilen reaktifi şırınga haznesine aspire edin.

Ve iğneyi timpanik membranın ön inferioruna yönlendirmek için spekulumu kullanın. Zardan bir delik açmak için iğneyi kullanın ve ilacın 50 mikrolitre hacminin tamamını uygulayın. Farenin bu pozisyonda 15 dakika dinlenmesine izin verin.

Daha sonra, fareyi sağ lateral dekübit pozisyonuna yerleştirin ve ilacı gösterildiği gibi sağ kulağa uygulayın. Sisplatin alan sıçanlar için, sıçanı 37 santigrat derece ısıtma yastığı üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve sisplatini 12 inçlik bir boru parçasına bağlı 21 ve üç çeyrek gauge kelebek iğneye çekin. Daha sonra, 30 dakika boyunca intraperitoneal enjeksiyon yoluyla mililitre sisplatin başına bir miligram uygulamak için bir şırınga pompası kullanın.

Sisplatinin tamamı verildiğinde, fareyi yüzüstü pozisyonda kafesine geri koyun, solunumunun engellenmemesine dikkat edin ve tamamen iyileşene kadar hayvanı izleyin. Tedavi sonrası ABR'nin ölçümünü takiben, fareyi sakit edin ve temporal kemiği inceleyin. Hasat edilen kokleayı PBS'de yüzde dört paraformaldehit içeren yedi mililitrelik bir cam sintilasyon şişesine yerleştirin ve gece boyunca dört santigrat derecede saklayın.

Ertesi sabah, kokleayı oda sıcaklığında PBS'de yıkayın. Ardından 120 milimolar EDTA'ya tamamen daldırılır. Ardından, kokleayı oda sıcaklığında iki ila üç hafta boyunca kireçten arındırmak için şişeyi bir döndürücüye yerleştirin.

Dekalsifikasyonun tamamlanmasının ardından, kokleayı dört santigrat derecede sakaroz çözeltisi başına 24 saat boyunca yedi mililitre sükroz ardışık daldırmalarına yerleştirin. Son daldırmadan sonra, 15 x 15 x 5 milimetre tek kullanımlık gömme kalıbına taze optimum kesme sıcaklığı bileşiğini ekleyin ve numune kalıbın tabanına paralel olacak şekilde kokleayı kalıba yan yatırın. OCT'yi katılaştırmak için kalıbı hemen kuru buzun üzerine yerleştirin ve kalıbı gece boyunca eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Ertesi sabah, kalıbı kuru buzun üzerine aktarın ve bir kriyostatı eksi 30 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, polilisin kaplı slayt başına iki adet on mikrometre koklea örneği elde etmek için keskin mikrotonlu bıçak kullanın. Slaytları dört santigrat derecede yerleştirin.

Kesitleri immünohistokimya ile analiz etmek için, slaytları bir cam mikroskop lam boyama kabına bir slayt rafına yerleştirin ve kesiti yıkama başına beş dakika boyunca 350 mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Son izlemeden sonra, her numunenin etrafındaki fazla PBS'yi çıkarmak için bir laboratuvar mendili kullanın ve her bölümü çevrelemek için hidrofobik bariyer kalemi kullanın. Numune başına 150 mikrolitre bloke edici solüsyon ile dokuları oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin.

İnkübasyonun sonunda, fazla bloke edici çözeltiyi doldurun ve numuneleri, nemlendirilmiş bir odada gece boyunca dört santigrat derecede 150 mikrolitre primer antikor ile inkübe edin. Ertesi sabah, slaytları yan raftaki boyama kabına geri koyun ve slaytları az önce gösterildiği gibi PBS'de üç kez yıkayın. Kesitleri uygun ikincil antikorlarla karanlıkta nemlendirilmiş odada oda sıcaklığında iki ila üç saat inkübe edin.

Kuluçka süresinin sonunda, slaytları boyama kabına geri koyun ve slaytları taze PBS'de üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, fazla PBS'yi çıkarmak için slaytlara hafifçe vurun ve slaytları bir laboratuvar mendiliyle kurulayın. DAPI ile desteklenmiş bir damla montaj maddesini doğrudan her doku bölümüne yerleştirin ve kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek her slaydın üzerine dikkatlice bir kapak fişi yerleştirin.

Ardından, numuneleri konfokal mikroskopi ile görüntülemeden önce slaytların karanlıkta oda sıcaklığında gece boyunca kürlenmesine izin verin. Sisplatin uygulamasından üç gün sonra sıçanlarda ölçülen işitsel beyin sapı yanıtları, sisplatin uygulamasından önce adenozin A1 reseptör agonisti R-PIA'nın transtimpanik iletimi ile tedavi edilen sıçanlarda azalan eşiklerde önemli bir yükselme gösterir. Tersine, A1 reseptörüne özgü bir antagonist olan DPCPX ile tedavi, sisplatin kaynaklı işitsel beyin sapı yanıt eşiği kaymalarını güçlendirir ve A1 reseptörü için R-PIA agonistinin özgüllüğünü gösterir.

Sisplatin ayrıca, taramalı elektron mikroskobu ile değerlendirildiği gibi dış saç hücresi kaybını ve hasarını arttırır, bu da transtimpanik R-PIA uygulaması ile önemli ölçüde azalan bir etkidir. Ayrıca, transtimpanik R-PIA, bu ilacın anti enflamatuar özelliğine uygun olarak, kokleanın dış tüy hücrelerinde bazal ve sisplatin kaynaklı fosfo stat1 immünoreaktivitesini azaltır. Transtimpanik yol, stat1 seviyelerini azaltmak ve bu transkripsiyon faktörünün örneğin sisplatin tarafından fosfo stat1'e aktivasyonunu bloke etmek için siRNA'lar gibi diğer biyolojikleri uygulamak için de kullanılabilir.

Ek çalışmalar, NOX3 siRNA'nın transtimpanik uygulamasının, kapsaisin kaynaklı işitme kaybında rol oynayan bazı alt akış aracılarının ekspresyonunu artırma yeteneğini kapsaisin gibi ilaçları azalttığını göstermektedir. Bu tekniği intratimpanik enjeksiyonda uygularken, hayvanın işlem sırasında hareket etmemesi için yeterince anestezi altına alınması zorunludur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu ilaç dağıtım sistemi, deney hayvanlarında ilaca bağlı saç dökülmesine karşı etkinlik için çok sayıda bileşiği taramak için kullanılabilir.