Zararlı etkileri, düşük basınç plazma sterilizasyon Bacillus subtilis sporlar kullanarak canlı cep mikroskobu sağkalıma soruşturma

Bu iletişim kuralı canlılık parametre ve düşük basınç plazma ile tedaviden sonra Bacillus subtilis sporlar canlandırıcı olarak DNA onarım işlemleri izleme alaka değerlendirmek için izleme tarafından gereken önemli ardışık adımlar gösterilmektedir Floresans etiketli DNA onarım proteinler confocal mikroskobu zaman karar vermek ve elektron mikroskobu tarama yoluyla.

Bu ardışık yöntemler setinin genel amacı, zamanla çözülmüş konfokal floresan mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak Düşük Basınçlı Plazma Tedavisinden sonra Bacillus subtilis sporlarının canlandırılmasında DNA onarımındaki canlılık parametrelerini görselleştirmek ve izlemektir. Yöntemimiz, Mikrobiyal İnaktivasyon ve Sterilizasyon alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Düşük basınçlı plazma işleminin Bacillus subtilis sporları gibi biyolojik göstergeler üzerindeki zararlı etkisini analiz etmemize yardımcı olur.

Tekniğimizin ana avantajı, düşük basınçlı plazma tedavisinin zararlı etkisini doğrulamak için zaman sonucu floresan mikroskobu kullanarak DNA onarımını görüntüleme, belirleme, taramalı elektron mikroskobu ve DNA onarımını izleme gibi çeşitli yöntemleri birleştirmemizdir. Spor üretimini gerçekleştirmek için, uygun antibiyotiklerle takviye edilmiş ilgili B.subtilis suşunun beş mililitrelik bir gece kültürünü 200 mililitre çift mukavemetli sıvı shafer sporülasyon ortamına aktarın ve kültürün% 95'inden fazlası sporlanana kadar en az 72 saat veya daha uzun süre 37 santigrat derecede kuvvetli havalandırma ile yetiştirilir. Sporları 15 mililitrelik tüplerde 3000 G'de 15 dakika santrifüjleme ile hasat edin ve numuneleri tekrarlanan yıkama adımlarında steril damıtılmış H2O kullanarak saflaştırın.

Yüz kontrastı miskroskopisi ile saflık ve çimlenme durumunu kontrol edin ve spor süspansiyonlarının faz parlak sporlarının %99'undan fazlasını içerdiğinden ve vejetatif hücreler, çimlenmiş sporlar ve hücre kalıntıları içermediğinden emin olun, aksi takdirde daha fazla mikroskopi deneyi bozulabilir. CFU'ları hesaplamak için LB agar üzerine 50 mikrolitre on katlı seri seyreltme kaplayarak spor titresini belirleyin ve plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. CFU tayinini takiben, numuneleri seyreltmek için konsantre ederek veya steril su kullanarak numuneyi mililitre başına 10 ila 9. spora ayarlayın.

Elektrikle çalışan aerosol püskürtme ünitesinin içine sterilize edilmiş mikroskobik slaytlar veya yuvarlak 25 milimetrelik kapak fişleri şeklinde bir numune taşıyıcıyı nozul ile aynı hizada yerleştirin. Spor kültürünü nozul sıvı girişine aktarın ve püskürtmeyi 0.15 saniyede 1.3 bar'lık bir basınçla başlatın. Püskürtülen spor süspansiyonu, mikroskobik slayt üzerinde, düzgün dağılmış bir spor mono tabakası oluşturmak için saniyeler içinde hızla kuruyan ince bir film oluşturur.

İşlem görmüş numune taşıyıcıları oda sıcaklığında steril bir kapta saklayın. Plazma sistemindeki tüm yüzeyleri temizlemek ve ısıtmak için, sistemi beş dakika boyunca 500 watt'ta Argon plazma ile beş Pascal'da başlatın. Ön arıtma, haznenin havalandırılması sırasında nitrojen, oksijen ve su gibi ortam havasından moleküllerin yapışmasını azaltır.

Hazneyi havalandırdıktan sonra, numuneleri reaktör kabının ortasındaki cam raflara dikkatlice yerleştirin. Odayı kapatın ve boşaltın. Daha sonra, hazneyi doldurmak için istenen proses gazını kullanın ve sistemdeki basıncı beş Paskal'a ayarlayın.

Ardından plazma işlemini başlatın. Tanımlanan işlem süresinden sonra, güç ve gaz beslemesini kapatın ve numunelerin numune tutucudan üflenmesini önlemek için sistemi dikkatlice havalandırın. Havalandırmadan sonra numuneleri çıkarın ve steril bir kapta saklayın.

Plazma ile muamele edilmemiş kontroller için, numuneleri yalnızca uygulanan en uzun plazma süresine eşdeğer proses gazının varlığında vakuma maruz bırakın. Otoklavlanmış% 10 polivinil asetat veya PVA'dan bir çözelti hazırlayın ve numune taşıyıcılarını dikkatlice örtmek için 500 mikrolitre kullanın. Dört saat boyunca kurumaya bıraktıktan sonra, şimdi spor örneğini içeren kurutulmuş PVA tabakasını sıyırmak ve 2 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarmak için steril forseps kullanın.

Tüpe bir mililitre steril su ekleyin ve çimlenme yeteneğine sahip sporların %95'inden fazlasını geri kazanmak için PVA tabakasını çözmek için girdaplayın. Numuneyi 96 oyuklu bir plakada bir ila 10 arasında seri olarak seyreltmek için steril su kullanın. LB agar üzerine her seyreltmeden 50 mikrolitre kapladıktan ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, koloni sayısını sayın ve mililitre başına CFU'ları belirleyin.

Çimlenme deneyleri için, 700 mikrolitre ortamı kaynatarak bir milimetre kalınlığında 1,5 LB agar pedi hazırlayın ve steril bir mikroskopi petrit içine pipetleyin. 10 dakika sonra, steril bir neşter kullanarak sekiz milimetreye sekiz milimetre LB agar pedini kesin ve agarı, önceden monte edilmiş 25 milimetrelik cam kapak kızakları üzerinde duran spor tek tabakalarının üzerine dikkatlice aktarın. Agar put yöntemi iki özel işlevi birleştirir.

Lazer mikroskobu sırasında numuneleri optik düzlemde stabilize eder ve yanal hücre hareketini kısıtlar. Çimlenme denemeleri için kullanılmasının yanı sıra, bu yöntem ökaryotik hücrelerin yanı sıra diğer mikroorganizmalara da uygulanabilir. Numuneyi agar ile kapladıktan sonra, cam kapak fişini hızlı bir şekilde bir görüntüleme odasına aktarın.

Tüm görüntüleme süreci boyunca numuneyi ısıtılmış bir aşamada 37 santigrat derecede tutun. Her koşul için en az üç biyolojik kopya kullanın. Numunelerin otomatik konfokal lazer tarama ve parlak alan mikroskobu ile görüntülenmesinin ardından,% 2,6'lık bir lazer gücüyle hızlandırılmış serileri kaydedin ve konfokal açıklığı beş aer birimine ve 30 saniyede bir kare örnek frekansına sıfırdan beş saate ayarlayın.

Yüksek dozlarda monokromatik ışık uygulamak, lazer mikroskobu sırasında spor çimlenmesini tamamen engelleyebilir. Bu nedenle, lazer yoğunluğunu kullanın ve tek kareler elde etmek için daha uzun aralıklarla kullanın. Spor toplanması, çok katmanlı spor dağılımı veya toz parçacıkları ile kirlenme durumunda, plazma işleminin tıkanması veya gölgelenme meydana gelebilir ve gölgeli sporların çimlenmesini sağlayabilir.

Taramalı elektron mikroskobunu gerçekleştirmek için, spor tek katmanları altın paladyum ile püskürtüldükten sonra, topografya kontrastını ortaya çıkarmak için bir inlan ikincil elektron dedektörü de dahil olmak üzere beş kilovolt hızlanma voltajında çalıştırılan alan emisyonu SEM ile numuneleri görüntüleyin. Bu grafikte gösterildiği gibi, B.subtilis sporlarının plazma tedavisi, plazma tedavisinin süresi arttıkça sağkalımda bir azalmaya neden olur. Bu SEM görüntüleri, tedavi edilmiş ve işlenmemiş tüm sporlarda sürekli olarak görülebilen karakteristik uzunlamasına sırt benzeri yapıları ortaya koymaktadır.

30 saniyeye kadar plazma tedavisi, kontrollere kıyasla spor yüzey morfolojisinde önemli bir değişikliğe neden olmaz. Plazma tedavisinin süresinin uzaması daha granüler bir yüzeye yol açar ve 120 veya 240 saniye boyunca tedavi edilen sporlarda küçük çatlaklar ve çatlaklar görülebilir. Bu zaman çözülmüş konfokal lazer tarama mikroskobu deneylerinde, bir kontrol olarak vakumla muamele edilen hemen hemen tüm sporlar çimlenir ve oldukça düzgün bir bireysel hücre uzunluğuna sahip çubuk şeklinde bir hücre morfolojisi geliştirir.

Buna karşılık, plazma ile 15 saniye boyunca muamele edilen sporlar, zaten yüzde 75 artı veya eksi dörtten daha az bir çimlenme kapasitesi göstermektedir. Ek olarak, hücreler ya çok uzun çubuklar halinde büyür ya da küçük kalır ve spor kaplamasına yapışır. 30 saniyelik plazma işleminden sonra, sporların sadece yüzde 25 artı veya eksi altısı filizlenir ve vejetatif hücrelerin büyümesi önemli ölçüde gecikir ve uzunlukları değişir.

Bu prosedürü denerken, üst üste binen veya çimlenen sporların olmadığından emin olmak için faz kontrast mikroskobu kullanarak spor tek katmanlarının kalitesini doğrulamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, görüntü sabitleme için agar ped yöntemi, plazma sterilizasyonu ve canlı hücre mikroskobu konusunda araştırmacıların önünü açtı. Bu videoyu izledikten sonra, cam slaytlar üzerinde spor tek katmanlarının nasıl hazırlanacağını, spor inaktivasyonu için plazma tedavilerini kullanarak kullanımın belirlenmesini ve canlı hücre ve taramalı elektron mikroskobu yapmayı daha iyi anlamalısınız.

Etilen oksit veya gama radyasyonu gibi diğer dekontaminasyon yöntemlerinin aksine, plazma sterilizasyonu hemen hemen her tür yüzeyde bir dizi istenmeyen mikroorganizmayı azaltmak için etkili ve güvenli bir yaklaşımdır.