Name: Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Öğrenin, çok alt birimli protein komplekslerinin mimarisini açıklamak için kimyasal çapraz bağlama ve natif kütle spektrometrisi yöntemlerini nasıl birleştireceğinizi. Bu teknik, yapısal biyolojide temel sorulara yanıt verir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bizim meslektaşları yararlı tartışmalar için teşekkür ederim. Biz de Ilme Schlichting ve Karl-Peter Hopfner protein kompleksleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz Federal Bakanlıktan eğitim ve araştırma için fon kabul (BMBF, ZIK programı, 03Z22HN22), Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (EFRE, ZS/2016/04/78115) ve MLU Halle-Wittenberg C.S. ve Wellcome Trust (109854/658 finansman Z/15/Z) A.P. için

Yazarlar ifşa gerek yok.

İletişim kuralları kütle spektrometresi tabanlı yapısal analizi çok alt birim protein kompleksleri için sağlanır. İletişim kuralında, açıklanan iki teknikleri, çoğunlukla tamamlayıcı sonuçlar ve protein içinde yapısal düzenlemeler anlayışlar kazanmak için uygundur (-ligand) tarafından geleneksel yapı teknikleri eğitim zor olan kompleksleri. Yerel kütle spektrometresi subcomplexes ve istikrarlı etkileşim modülleri analiz ederek protein stoichiometries yanı sıra protein etkileşimleri içine anlayışlar sunar. İlişkilendirerek, öte yandan, doğrudan ilgili siteler hakkında bilgi verir. Bağlı olarak kullanılan cross-linker, belirli bir esneklik olabilir veya analize dahil.
Genel olarak gerçekleştirmek kolay ve değil zaman alıcı sağlanan kurallarıdır. Tüm iletişim kuralı bir hafta içinde çalıştırılabilir ve belirli bir miktarda protein kompleksi başarılı analiz için gerekli olmasına rağmen hemen hemen tüm protein kompleksleri için uygulanabilir. Numune hazırlama basittir ve özellikle saf protein kompleksleri gerektirmez. Ancak, yaygın bir hatadır kütle spektrometresi tabanlı protein tanımlama için numune hazırlama sırasında örnek kirlenme var. Çoğu durumda bu contaminations toz, deri veya saç kaynaklanan keratins içerir. Bu nedenle, eldiven ve laboratuvar mont giyiyor gibi ilave, Sulu arabellekleri filtrating ve yüksek saflıkta çözücüler kullanılarak kütle spektrometresi tabanlı protein tanımlama için numune hazırlama sırasında özen gösterilmelidir. Benzeşme Etiketler kullanırken chaperones gibi bulaşıcı diğer proteinler protein arıtma sırasında örneğin, genellikle tanıtılmaktadır. Bu gibi durumlarda, protein saflaştırma, örneğin çamaşır adımları artırarak geliştirilmesi. Her durumda, örnekteki protein contaminations kolayca veritabanı arama sırasında taksonomi filtre ihmal olarak tanımlanır (Yani, tüm türlerden proteinler karşı arama). Eğer sadece birkaç peptidler gözlenir (Yani, düşük protein kapsama elde edilebilir), yeterli örnek kullanılabilir olsa bile, farklı bir İndinavir sindirim sırasında kullanmak gerekli olabilir. Genel olarak tripsin peptidler yeterli sayıda verir; Ancak, membran proteinlerinin veya proteinlerin membran etki alanları gibi bazı durumlarda tryptic bölünme sitelerin sayısı azalır ve hidrofobik amino asitler hedefleme diğer enzimler daha iyi bir seçimdir.
Araçları açısından, özellikle değiştirilmiş bir enstrüman gaz fazına aktarmadan kovalent olmayan etkileşimleri tutar yerli kütle spektrometresi gereklidir. Q-ToF ve orbitrap aletler dahil olmak üzere çeşitli araç türleri getirilmiştir. Değiştirilmiş Q-ToF Kütle Spektrometre Sistemleri beri birkaç yıl için yerel kütle spektrometresi ticari olarak mevcut olmakla birlikte, ikinci ancak son zamanlarda kullanılmaya başlanan ve çoğu durumda özel değişiklik45gerektirir. Ancak, uygulama yüksek çözünürlüklü aletleri bağlama birden çok ligandlar ve onların miktar46,47 eğitim izin ve gelecekteki uygulamalar için umut verici.
Çapraz bağlı di-peptidler tarafından sıvı Kromatografi birleştiğinde kütle spektrometresi tanımlamak için birkaç değişiklik ile standart yordamlar uygulayabilirsiniz. Ancak, veritabanı arama sınırlayıcı bir faktör olarak özel yazılım nadiren büyük veritabanları ile başa çıkabilirim ve kompleksleri protein alt içeren azaltılmış veritabanları gerekli olur. Son yıllarda yapılan çalışmalarda kullanılan Kütle spektrometresi yarilabilir cross-linkers protein etkileşimler tüm hücre lysates48,49hedefleme. Tandem kütle spektrometresi deneylerde çoğunlukla parçası kimyasal cross-linkers kullanımı daha fazla parçalanma tarafından tanımlanan, (cross-linker tarafından değiştirilmiş) doğrusal peptidler verimleri ve doğrusal peptidler ve bu veritabanı arama azaltır arama süresi ve Hesaplamalı Arama alanı. Ancak, bu deneyler gerçekleştirmek için bir iyon kapanı kitle Analyzer'ı veya bir melez Kütle Spektrometre ile bir iyon kapanı gereklidir. Yanlış-mutlak önemli bir konu olduğundan, genel olarak, çapraz bağlı peptidler kitle spectra kez el ile veri analiz süresini son derece uzanan kalitesi onların parçası spectra ile doğrulanır. Daha fazla doğrulama adımları bu nedenle potansiyel gelecekteki uygulamalar olmadan, uygulanacak sağlam puanlama sistemlerinin geliştirilmesi. Veri Çözümleme geliştirmek ve yanlış-mutlak sayısını azaltmak için bir yol yanlış bulma oranı hesaplamalarını ve veri kümeleri50cross-linking üzere giriş oldu.
Genel olarak, burada açıklanan teknikler daha fazla kütle spektrometresi teknikleri ile tamamlanmaktadır (örneğin, kovalent etiketleme) analizi çıktısı artırmak için. Diğer değişiklikler ve geliştirmeler iletişim kurallarının kolayca uygulanabilir. Bu nedenle karşılaştırmalı cross-linking34 protein derlemesinde konformasyon değişiklikleri unravels. Daha fazla yerel kütle spektrometresi gelişmeler günümüzde membran proteinleri51,52 analizi ve onların etkileşim lipidler28,52,53,54 ile izin . Yüksek çözünürlüklü Kütle Spektrometreleri yerli kütle spektrometresi için yeni gelişmeler uygulama ve ligand taşıması, örneğin, lipitler membran proteinlerinin için bağlama genişletilmiş var, şimdi analiz45', dahil edilebilir 46. sayısal modelleme yaklaşımlar ile birlikte, bu tekniklerin çözünürlük55değişen Yapısal modeller sunabilirsiniz. Hiçbir Kristal yapıları olduğu gibi karmaşık veya tek alt birimleri için kullanılabilir varsa, kütle spektrometresi ilk yorumlara protein etkileşimleri ve bilinmeyen karmaşık topoloji teslim edebilirsiniz. Kullanılan teknikler ve elde edilen sonuçlar bağlı olarak, düşük çözünürlüklü modeller bilinmeyen kompleks56,57,58elde edilebilir. Kristal yapıları veya homoloji modelleri kullanılabiliyorsa, kütle spektrometresi alınan yapısal bilgi bile yakınındaki yerli modelleri59yol açabilir.
Diğer yapısal teknikleri ile karşılaştırıldığında, kütle spektrometresi avantajı vardır bu düşük örnek gerektiren, türdeş olmayan örnekleri ile başa çıkabilirim ve Sınırsız büyüklükte protein kompleksleri için geçerlidir. Ayrıca, kütle spektrometresi dinamik protein sistemleri araştırma sağlar. Çözüm içinde protein veya protein kompleksi farklı nüfus genellikle birlikte analiz edilir ve bu nedenle, farklı olarak belirli nüfusun seçimi gerektiren diğer yapısal teknikleri ile tüm biçimler sırasında korunur analiz ve olan bir deneyde değerlendirilebilir. Kantitatif yaklaşımlar cross-linking son zamanlarda tanıtılan34,60,61 ve gelecekteki uygulamalar farklı koşullar altında konformasyon değişiklikleri açıklayan için umut verici.

Protein derlemeler yapısal incelenmesi özellikle hücresel süreçleri anlamak için önemli hale gelmiştir. Sonuç olarak, birçok teknikleri geliştirilmiş ve Yapısal Biyoloji1' geliştirilmiş. Ancak, bu teknikler bazen onların uygulama boyutu, esneklik veya protein kompleksleri soruşturma altında heterojen nedeniyle sınırlıdır. Kütle spektrometresi bu zorlukları ile başa çıkabilirim ve bu nedenle, Yapısal Biyoloji2,3,4,5güçlü bir araç olarak ortaya çıktı. Kütle spektrometresi, en büyük avantajı ise belirsizliğe yer bırakmadan proteinler bile karmaşık ve heterojen karışımları6' tanımlama yeteneği. Bu amaçla, proteinler genellikle endoproteinases ile sindirmek ve elde edilen peptid karışımı sıvı Kromatografi tarafından ayrılmış ve doğrudan Kütle Spektrometre eluted. Peptid kitleler daha sonra belirlenir ve öncü iyonlar daha fazla peptidler parçalanma için seçilir. Proteinler sonra arama peptid ve bilinen bir veritabanında karşılık gelen parçası kitleler tarafından tanımlanır. Bu yordam sadece peptidler/protein değil, aynı zamanda bir kitle değişim habercisi peptidler ve değişiklik7taşıyan parçası iyonları neden onların translasyonel modifikasyonlar kimliği verir. Bazı yapısal kütle spektrometresi birçok teknikler üzerinde bu ilke4,8temel alır. Örneğin, hidrojen döteryum Satım9,10gibi teknikleri etiketleme, kimyasal etiketleme stratejileri11,12veya radikal hidroksil ayak baskı13,14 , yüzey erişilebilirlik belirli koşullar altında proteinlerin içine anlayışlar verebilir.
(Amino asitlerin birbirine yakın onların fonksiyonel gruplar aracılığıyla kovalent bağ içeren cross-linking kimyasal) başka bir tekniktir. Bunun için istihdam15,16kimyasal reaktifler, UV alınabilen reaktifler veya amino asitler vardır. İlişkilendirerek sonra proteinler genellikle proteaz ile hidrolize ve çapraz bağlı di-peptidler tarafından sıvı Kromatografi birleştiğinde kütle spektrometresi analiz edilir. Cross-linking ürünler arama, veritabanı tarafından kimlik ancak, çeşitli proteinler ve birbirinden farklı bölgeler17,18,19peptid dizileri bir arada özel yazılım kullanımı gerektirir. Kimyasal cross-linkers kullanımı ilgi hemen hemen her protein kompleksi için istihdam ve does değil istemek sadece protein konak hücreleri ilgi ifade edilirken elde edilebilir ve UV alınabilen amino asitler, birleşme avantajı vardır. Bu nedenle, cross-linking çok yönlü bir araçtır ve başarıyla birçok yapısal bile büyük protein derlemeler20çalışmalarda istihdam edildi.
Kütle spektrometresi (bazen olarak adlandırılır 'Yerel' kütle spektrometresi) olduğu gibi protein kompleksleri, diğer taraftan, peptidler sağlam protein ve protein kompleksleri hidroliz olmadan analizini içerir. Kompozisyon, heterojenlik, stoichiometry, topoloji ve alt birim etkileşimleri protein kompleksleri21,22ortaya koymaktadır. İyon hareketlilik ile birlikte, yerel kütle spektrometresi daha da onların uyum23,24tayini sağlar. Bu geleneksel yapı teknikleri tarafından değerlendirmek zordur protein kompleksleri yapısal incelenmesi için güçlü bir araç sağlar. Ancak, yerel kütle spektrometresi kovalent olmayan protein etkileşimleri electrospray iyonlaşma sırasında korumak analiz arabellekleri gerektirir. Bu genellikle sulu, uçucu arabellekleri amonyum asetat25gibi kullanılarak elde edilir. Buna ek olarak, araç değişiklikler ayrılma Kütle Spektrometre26gaz fazına iletim sırasında önlemek gereklidir. Bu şekilde uygulanan, birçok (büyük) protein kompleksleri analiz edildi. Sağlam ribozomlara27, ATP synthases28veya virüs29çalışmaları etkileyici örnekleridir.
Yerel kütle spektrometresi ve cross-linking önceki çalışmalarda özellikle başarılı oldu. Kimyasal cross-linking proteinler arasında düzenlemelerin ortaya iken Örneğin, refakatçi kompleksleri, beklenmedik bir Hsp70 dimer dahil olmak üzere stoichiometries olduğu gibi protein kompleksleri kütle spektrometresi deneylerden elde edilebilir derlemeler30,31. Farklı bir çalışmada, karmaşık bir bozulmamış ATP sentaz üzerinde translasyonel modifikasyonlar etkileri incelenmiştir. Yerel kütle spektrometresi protein kompleksi istikrar anlayışlar fosforilasyon veya asetilasyon32,33içinde sağlanan. Karşılaştırmalı cross-linking strateji34 sonra farklı koşullar altında karmaşık proteinin konformasyon değişiklikler ortaya çıkar.
Burada, protein tanımlama için kütle spektrometresi, (kimyasal) cross-linking ve veri analizi ve yorumu (şekil 1) dahil olmak üzere yerel kütle spektrometresi tarafından protokolleri sağlamak. Tamamlayıcı sonuçları iki iyi karakterize protein kompleksleri yardımıyla bu yöntemlerle elde edilen gösterdiği35birleşimidir. Bizim iletişim kuralı belirli saflık ve konsantrasyon saf herhangi bir protein bütünleştirilmiş uygulanabilir. Yaklaşım veri, Yani, veritabanının boyutunu cross-linking veri analizi tarafından sınırlı bazı durumlarda, gerekli arama uzay ve zaman belirler istihdam edilmektedir. Buna ek olarak, belirlenen çapraz bağlantıları el ile doğrulama kez gereklidir ve çıkış daha da azaltır. Yerel kütle spektrometresi çoğunlukla örnek kalite, örneğin, arabellekleri tarafından sınırlıdır ve adducts onları sulu ve uçucu arabellekleri tarafından Döviz için arıtma ve olasılığını sırasında kullanılan. Ancak, yapısal analiz için genellikle saf protein kompleksleri bizim protokol ile başarılı analiz için gerekli kalite var.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Kimyasallar, Reaktifler, Sarf Malzemeleri< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>2- [4- (2-hidroksietil) piperazin-1-il] etansülfonik asit (HEPES)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>tampon</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>pH</td></tr><tr><td>Asetonitril Optima LC / MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A955-1</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Amicon Ultra santrifüj cihazlar (farklı MWCO)</td> <td>Millipore</td><td>yani UFC500396</td><td>tampon değişimi, konsantrasyon</td></tr><tr><td>Amonyum asetat çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2706</td><td>yerli MS</td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td>jel içi sindirim</td></tr><tr><td>Amonyum çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9859</td><td>pH</td></tr><tr><td>Bis (Sülfosüksinimidil) suberate-d0 (BS3-d0)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>21590</td><td>çapraz bağlayıcı</td></tr><tr><td>Bis (Sülfosüksinimidil) suberat-d4 (BS3-d4)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>21595</td><td>çapraz bağlayıcı</td></tr><tr><td>Sezyum iyodür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203033</td><td>kalibrasyon</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>jel içi sindirim</td></tr><tr><td>Kılcal damarlar (1.0 OD ve kez; 0.78 ID ve kez; 100 L mm)</td> <td>Harvard Aparatı</td><td>30-0038</td><td>yerli MS</td></tr><tr><td>Diseksinimidil suberat (DSS)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>21655</td><td>çapraz bağlayıcı</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545</td><td>jel içi sindirim</td></tr><tr><td>DMSO (dimetil sülfoksit)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>BP2818</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Formik asit Optima LC / MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>solvent takviyesi</td></tr><tr><td>Anında Blue Coomassie boyama solüsyonu</td><td>expedeon</td><td>ISB1L</td><td>jel elektroforezi için boyama solüsyonu</td></tr><tr><td>Invitrogen NuPAGE %4-12 Bis-Tris jeller (1 mm, 10 kuyulu)</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>NP0323BOX</td><td>jel elektroforezi</td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Jel içi sindirim</td></tr><tr><td>İzopropil alkol, HPLC sınıfı</td><td>Fisher Kimyasalları</td><td>P750717</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A456-212</td><td>çözücü</td></tr><tr><td>Mikro BioSpin 6 sütun</td><td>BioRad</td><td>732-6222</td><td>tampon değişimi</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioksidan</td><td>invitrojen</td><td>NP0005</td><td>çalışan tampon, jel elektroforezi</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Numune Tamponu (4 >)</td>Jel elektroforezi için <td>invitrogen</td><td>NP0007</td><td>numune yükleme tamponu (indirgeyici olmayan)</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Çalışan tampon</td><td>ömrü teknolojileri</td><td>NP0001</td><td>jel elektroforezi</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Çalışan tampon</td><td>ömrü teknolojileri</td><td>NP0001</td><td>jel elektroforezi</td></tr><tr><td>NuPAGE Numune Azaltıcı Ajan (10 &/)</td><td>Jel elektroforezi için</td> <td>invitrojen</td><td>NP0004</td> indirgeyici Ajan</tr><tr><td>PBS - fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>tamponu</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Önceden Boyanmış Standart Protein İşaretleyici</td><td>invitrogen</td><td>LC5925</td><td>jel elektroforezi için önceden boyanmış Protein İşaretleyicisi</td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>etanol çökeltme</td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil)aminometan (Tris)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td>tamponu</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td> <td>jel içi sindirim</td></tr><tr><td>Vivaspin santrifüj cihazları (farklı MWCO)</td> <td>Sartorius</td><td>yani VS0101</td><td>tampon değişimi,</td></tr><tr><td>konsantrasyon HPLC Sigma</td><td>Aldrich</td><td>270733-2.5L-M</td><td>için su çözücü</td></tr><tr><td><güçlü > < / güçlü></td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments<</td></tr><tr><td>strong>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Heraeus Fresco 21, tezgah üstü santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Alevli / Kahverengi Mikropipet çektirme Model P-1000</td><td>Sutter Aletleri</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Jelelektroforez odası Xcell SureLock MiniCell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Altın Kaplayıcı Çekirdek Q150R S</td><td>Çekirdek Teknolojileri Ltd.</td><td>Q150RS</td><td></td></tr><tr><td>Yatay jel çalkalayıcı Rotamax 120 T</td><td>Heidolph Instruments</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Q-TOF Ultima kütle spektrometresi, MS Vision yüksek kütle yükseltmesi</td><td>Sular (Mikrokütle)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ters fazlı C18 analitik kolon Acclaim PepMap (C18, 75 mm İç Çap, 50 cm, 3 mm gözenek boyutu)</td><td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td></td></tr><tr><td>ters fazlı C18 ön kolon (C18, 150 mm İç Çap, 2 cm, 5 mm gözenek boyutu)</td><td>Thermo Scientific</td><td>164213</td><td></td></tr><tr><td>neşter</td><td>Fisher Scientifc</td><td>10463989</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac SPD121P vakumlu santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD121DP-230</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız AA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z680184-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik temizleyici USC-TH, sonikasyon banyosu</td><td>VWR</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate Dionex 3000 nano-LC sistemi, Q-Exactive plus hibrit kütle spektrometresine bağlı (nano-ESI kaynağı)</td><td>Thermo Scientific</td><td>0726030+</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td><güçlü >Yazılım, Yazılım Araçları, Veritabanı araması</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>www.matrixscience.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massign</td><td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Micromass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassMatrix</td><td>Xu, HJ Proteome Res. 9 (2010)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>Cox, J. Nat. Biyoteknoloji. 26 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLink</td><td>Yang, B. Nat Yöntemler 9 (2012)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pXtract dönüştürme aracı</td><td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UniDec</td><td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCalibur</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XiNET</td><td>http://crosslinkviewer.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XLinkX</td><td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xQuest</td><td>Rinner, O. Nat Yöntemleri 5 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvis</td><td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kimyasal cross-linking ve çoklu alt birim protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

Proteinlerin çeşitli hücresel işlevlerini gerçekleştirecek formu etkin ve dinamik derlemeler için onların ligandlar etkileşim. Bu etkileşimler elucidating bu nedenle hücresel süreçleri anlamak için esastır. Ancak, birçok protein kompleksleri dinamik derlemeler ve konvansiyonel yapısal teknikleri tarafından erişilebilir değildir. Kütle spektrometresi bu derlemeler yapısal araştırmaya katkıda bulunur ve özellikle çeşitli kitle spektrometrik tekniklerin birleşimi kendi Yapısal düzenleme değerli içgörüler sunar.
Bu makalede, biz uygulama ve iki tamamlayıcı kitle spektrometrik tekniklerin birleşimi tanımlamak, yani kimyasal cross-linking kütle spektrometresi ve yerel kütle spektrometresi ile birleştiğinde. Kimyasal cross-linking amino asitlerin birbirine yakın kovalent bağ kimyasal reaktifler kullanarak içerir. Sonra sindirim proteaz ile çapraz bağlı di-peptidler kütle spektrometresi tarafından tanımlanır ve protein etkileşimleri ele geçen sitelerdir. Yerel kütle spektrometresi Öte yandan bir Kütle Spektrometre gaz aşamasında olduğu gibi protein derlemeler analizidir. Protein stoichiometries yanı sıra protein ve ligand etkileşimleri ortaya koymaktadır. Her iki tekniğin de bu nedenle protein-ligand derlemeler ve onların birlikte önceki çalışmalarda güçlü olduğunu kanıtladı yapısını tamamlayıcı bilgi sunar.

Yapısal proteinler ve onlar formu kompleksleri onların işlevini anlamak için temel analizidir. Boyutu ne olursa olsun ilgi hemen hemen her karmaşık uygulanabilir veya heterojenite örnek kütle spektrometresi yapısal soruşturma için önemli ölçüde katkıda bulunur. Protokol iki iyi karakterize protein kompleksleri kullanarak örnekler; ilk olarak, hetero-dodecamer RvB1/B2 C. thermophilum ve saniye, hetero-octameric CPS E. colikarmaşık.
İlk kez, iki kompleksleri protein bileşenleri tespit. Bunun için proteinler SDS-PAGE tarafından (Şekil 2) ayrı kaldık ve jel bantları jel kesilmiş. Jel sindirimi proteinlerin sonra peptid karışımı tarafından sıvı Kromatografi birleştiğinde kütle spektrometresi analiz edildi ve peptid ve parça kitleler veritabanı arama için tabi tutuldu. Bu iş akışını takip biz yüksek güven ile Yani, tüm protein alt iki kompleksleri, tespit peptidler makul peptid puanları ile çok sayıda yüksek sıra kapsama tüm protein alt (Tablo 1 için verimli gözlenmiştir ).
Biz o zaman yerli kütle spektrometresi (şekil 3A) tarafından olduğu gibi RvB1/B2 karmaşık analiz edildi. Kütle spektrumu iki tür, bir yaklaşık 8.000 m/z ve başka bir tür yaklaşık 11.000-12.000 m/zsaptandı. Bu türler için hesaplanan kitleler hexameric (RvB1)3(RvB2)3 yüzük (yaklaşık 310 kDa) ve dodecameric çift-ring (RvB1)6(RvB2)6 (yaklaşık 620 kDa) karşılık gelir. Her iki tepe serinin iki popülasyonun gösterisi; Bunlar onun etiketli ve etiketsiz RvB2 alt birimleri komplekslerinde karışımı kaynaklı. RvB1/B2 karmaşık için kristal yapısı daha önce36 elde edildi ve çift-ring (şekil 3B) yerleşimi gösterir. Yerel kitle spektrum olduğu gibi dodecamer stoichiometry bu nedenle onaylar ve ayrıca istikrarlı bir alt kompleksi ortaya koymaktadır. Buna ek olarak, ortak mevcut nüfus tanımlanır.
RvB1/B2 kompleks içinde protein etkileşim siteleri belirlemek için biz kimyasal olarak saf karmaşık BS3 cross-linker ile cross-linked. İlk BS3 miktarı en yüksek konsantrasyonu belirlemek için cross-linking reaksiyonu sırasında titre. BS3 Amin özgü ve kovalent bağlantılar lizin yan zincirleri gibi proteinlerin N termini olduğunu. Cross-linking tepki SDS-PAGE tarafından (şekil 2A) izledi. Çapraz bağlantılı kompleks RvB1 ve RvB2 alt birimleri gösterdi. BS3 reaksiyon karışıma ekleyerek protein bantları daha yüksek molekül ağırlıklı, sonuçlanan proteinlerin kovalent bağ neden oldu. SDS jel çapraz bağlı protein alt azalır iken BS3 miktarda artan çapraz bağlı türler daha yüksek miktarlarda verim gösterir. Daha sonra jel protein grup kesmek ve protein etkileşim siteleri tanımlamak için yukarıda verilen protokolü takip ettim. Bir çapraz bağlı di-peptid bir örnek spektrum (şekil 3 c) gösterilir. Yelpazenin her iki peptidler bu protein etkileşimi teyit y-iyon dizi gösterir. Toplamda, alt birimleri RvB1 ve RvB2 ve RvB2 iki kopyası arasındaki iki çapraz bağlantıları arasında dört çapraz bağlantıları da dahil olmak üzere 14 protein etkileşimler elde edilen (Tablo 2). BS3 sonuçlarından Cross-linking intra moleküler etkileşimleri yanı sıra farklı alt birimleri arasındaki etkileşimleri gösteren bir etkileşim ağı (şekil 3D) içinde görüntülenir. İntra moleküler çapraz bağlantıları tavsiye ederim RvB1 ve RvB2 alt birimleri N ve C terminali etki alanları yakın bir şekilde katlayın. Dikkat, intra moleküler etkileşimler aynı alt birim arası moleküler etkileşim bu durumda seçkin olduğunu. İki alt birimleri arasında arası moleküler çapraz bağlantıları da tespit edildi. Bunlar cross-linking yaklaşım doğrulama yapısı içinde RvB1 ve RvB2 arasında iki arası moleküler çapraz bağlantıları görüntülenmeyecektir. Diğer arası moleküler çapraz bağlantıları kristal yapısı içinde bulunmayan esnek döngüler içinde yer alır. Biz de aynı peptid dizileri içeren iki çapraz bağlantıları RvB2 içinde tespit. Bu çapraz bağlantıları belirsizliğe yer bırakmadan aynı protein (şekil 3D) iki kopyasını kaynaklanan gerekir arası moleküler olarak sınıflandırılabilir. Bizim cross-linking deneyler protein etkileşim siteleri kompleksi içinde aynı zamanda varolan kristal yapısı (şekil 3B) tarafından da teyit kendi Yapısal düzenleme anlayışlar sağlayan protein alt içinde ortaya koyuyor.
Biz okudu ikinci protein kompleksi CPS yapıldı. Yerel kitle spektrum (şekil 4A) üç protein kompleksleri arasında 6000 ve 12.000 m/zsaptandı. 640 kDa en büyük karmaşık olduğu gibi hetero-octamer karşılık gelir. Daha küçük kompleksleri iki alt kompleksleri temsil eder; küçük ve büyük CPS altbirimden (160 kDa) ve her alt birim (320 kDa) iki kopyasını içeren bir heteroseksüel tetramer dimer. Bu alt komplekslerin protein derleme içine ilk anlayışlar teslim; Yani, büyük ve küçük alt birimleri doğrudan temas (hetero-dimer tarafından ortaya gibi) ve tetramer iki dimer bir ürün olabilir. Sağlam CPS karmaşık yapısal düzenleme hakkında daha fazla bilgi elde etmek için tandem kütle spektrometresi (MS/MS) hetero-octamer ve heteroseksüel tetramer gerçekleştirilen. Her iki durumda da habercisi küçük alt birim derleme (4B rakam) çevre içinde yer aldığını öne üzerinden ayrışmış küçük alt birim. Gerçekten de, küçük alt birim kullanılabilir kristal yapısı (şekil 4 c)44periferik.
Kimyasal BS3 cross-linker kullanarak cross-linking da gerçekleştirildi. Artan miktarda kullanarak, CPS alt birimleri kovalent bağ geliştirilmiş oldu. Proteinlerin sindirimi ve yukarıda açıklandığı gibi peptidler analiz sonra birçok protein etkileşimleri büyük alt birim ve küçük alt birim içinde bir hibrid içinde (Tablo 2) elde edilmiştir. Ayrıca, benzer şekilde RvB1/B2 karmaşık, büyük CPS alt birim iki kopyası arasındaki iki arası moleküler çapraz bağlantılar bulduk. Bu çapraz bağlantıları her C-terminal yan yana karşı karşıya iki büyük alt birimleri yerleştirin. Bir önceki çalışmada, yapısal kütle spektrometresi ve sayısal modelleme35, biz hangi büyük olasılıkla iki büyük alt birim tarafından onaylanmış kopyalarını arabiriminden kaynaklanan üç ek etkileşimleri büyük alt birim olarak tespit kristal yapısı ve elde edilen modeli (şekil 4 c ve Tablo 2). Bu etkileşimler CPS çekirdek düzenlenmesi dört büyük alt birimleri oluşan karmaşık olanak sağlar. Ancak, küçük ve büyük alt birimleri arasında hiçbir arası alt birim çapraz bağlantıları tespit edildi. Kullanılabilir kristal yapısı (şekil 4 c) inceleyerek, hangi açıklayabilir büyük alt birim ve periferik küçük alt birimleri oluşan kompleks tetrameric çekirdek arasındaki etkileşim yüzey çok küçük olduğunu ortaya çıkıyor arası alt birim etkileşimleri olmaması. Bu küçük alt birim kolayca sağlam kompleksler küçük bağlama arabirimi nedeniyle büyük olasılıkla gelen ayrışıp gösterdi yerli kütle spektrometresi tarafından doğrulanır. Yine de, CPS karmaşık kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi birlikte protein etkileşimleri kendi Yapısal düzenleme (şekil 4 d) araştırma izin.
Birlikte ele alındığında, yerel kütle spektrometresi ve kimyasal çapraz bağlı peptidler, kitle spektrometrik tanımlaması ile birleştiğinde cross-linking kombinasyonu her iki örnek kompleksleri yapısal düzenlemenin sulandırma sağlar. Kimyasal ilişkilendirerek ortaya protein alt, örneğin etkileşim RvB1 ve RvB2 arasında veya CPS, tetrameric çekirdek içinde düzenlenmesi sırasında yerel kütle spektrometresi protein stoichiometries sağlam kompleksleri, teslim ve yaygın subcomplexes. CPS, kendisi için hiçbir arası moleküler etkileşim iki alt birimleri arasında kimyasal cross-linking tarafından gözlenen durumunda büyük her alt birim bir küçük alt (şekil 4 d) ile etkileşim yerli kütle spektrometresi öneriyor. Tandem kütle spektrometresi önerilen bir karmaşık ve her iki alt birimleri arasında küçük bir arabirim küçük alt birimi periferik yerleşim.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> Şekil 1: iş akışı yerel kütle spektrometresi ve cross-linking. Her iki tekniğin de tamamlayıcı sonuçlar. Yerel kütle spektrometresi stoichiometries ve etkileşim modülleri ortaya koymaktadır iken, cross-linking kompleksleri içerisinde protein etkileşim siteleri anlayışlar verir. Not Yalnızca kimyasal cross-linking ikili etkileşimleri ortaya koymaktadır. (A) yerel kütle spektrometresi ilk adımda uçucu ve sulu arabellek filtre cihazları veya jel filtrasyon sütunları kullanarak Exchange'e arabellek olduğunu. Kütle spektrometresi sağlam protein kompleksleri, sonra kendi stoichiometry ortaya koymaktadır. Tandem kütle spektrometresi deneylerde periferik alt birimleri ayrışmış. (B) kimyasal cross-linking için protein kompleksi cross-linking reaktif ile inkübe. Çapraz bağlı protein sonra tarafından sıvı Kromatografi birleştiğinde kütle spektrometresi daha sonra analiz peptidler içine sindirmek. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> Şekil 2: SDS-sayfa, çapraz bağlı RvB1/B2 (A) ve CPS (B) kompleksleri. (A) 2.5 µM RvB1/B2 jel lane yüklü. BS3 konsantrasyonu çeşitli. Sigara çapraz bağlı RvB1/B2 yaklaşık 50 kDa iki protein alt gösterir. BS3 yanı sıra protein bantları daha yüksek molekül ağırlıklı, sonuçlanan protein alt kovalent bağ neden oldu. Çapraz bağlı türler miktarı ile daha yüksek BS3 konsantrasyonları artar. Optimal koşullar cross-linking vurgulanan (kırmızı) vardır. (B) 10 µM CPS jel lane yüklü. Büyük (90 kDa) ve küçük (40 kDa) CPS alt birimleri elde edilir. BS3 yanı sıra protein bantları daha yüksek molekül ağırlıklı, sonuçlanan protein alt kovalent bağ neden oldu. Optimal koşullar cross-linking vurgulanan (kırmızı) vardır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> Şekil 3: Yerel kütle spektrometresi ve kimyasal RvB1/B2 karmaşık cross-linking. (A) yerel kitle spektrum RvB1/B2 ortaya iki tür; sağlam dodecamer (Yani, (RvB1)6(RvB2)6) yaklaşık 11.000-12.000 m/z ve hexameric yüzük (RvB1)3(RvB2)3 yaklaşık 8.000 m/z. Her iki tür iki popülasyonun onun etiketli ve etiketsiz RvB2 kaynaklanan göster. Spektrum35değiştirildi. RvB1/B2 (B) kristal yapısı (PDB kimliği 4WVY) gösterilir. RvB1 ve RvB2 alternatif alt birimleri iki hexameric halkalar oluştururlar. (C) bir çapraz bağlı di-peptid parçalanma spektrum. N-terminus RvB1, çapraz bağlı, RvB1. K23 ile her iki peptidler (kırmızı ve mavi) için y-iyon serisi elde edilmiştir. RvB1/B2 karmaşık elde (D) içi ve arası protein etkileşimler. Intra-net çapraz bağlantılar kırmızıyla gösterilir inter-cross-links mavi renkle gösterilir. Eklemek hangi kristal yapısı (yeşil, INSERT) görüntülenmeyecektir RvB1 ve RvB2 alt birimleri arasında iki arası moleküler çapraz bağlantıları gösterir. İki RvB2 kopya--dan kaynaklanan etkileşimleri mavi noktalı çizgiler olarak gösterilmiştir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> Şekil 4: Yerel kütle spektrometresi ve kimyasal CPS cross-linking. (A) CPS gösterir yerel kütle spektrumu üç kompleksleri. Hetero-dimer (160 kDa), hetero-tetramer (320 kDa) ve hetero-octamer (640 kDa). Spektrum35değiştirildi. (B) tetrameric ve octameric CPS karmaşık ortaya ayrılma bir küçük CPS alt birimi Tandem kütle spektrometresi. (C) kristal yapısı CPS (PDB kimliği 1BXR) gösterilir. Büyük alt birimleri bir tetrameric oluşturmak ve küçük alt birimleri kompleksi çevre içinde yer alır. İki büyük alt birim kopyaları arasındaki arası moleküler çapraz bağlantıları (yeşil) gösterilir. Büyük ve küçük CPS alt birimleri (D) etkileşimleri. Yerel kütle spektrometresi subcomplexes ortaya ve küçük alt birim periferik konumunu göstermektedir. Kimyasal çapraz bağlantıları tetrameric temel düzenlemeler CPS gösterir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo 1: veritabanı arama sonuçlarını. Proteinler sıvı Kromatografi birleştiğinde kütle spektrometresi ve veritabanı arama tarafından tespit edilmiştir. Protein adları katılım numarası ve açıklaması gibi protein kitle verilir. Protein puanı, protein başına gözlenen spectra sayısı ve gözlenen peptid sıraların sayısını belirtir. En yüksek maskot peptidler puanları ile beş peptidler her protein alt birimi için listelenir. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo 2: çapraz bağlantıları gözlenen RvB1/B2 ve CPS. Alt birimleri kompleksleri ve çapraz bağlı artıkları verilir. Hibrid türünü (Intra - veya arası moleküler) çakışan peptid sýra ya da bir önceki çalışma35ortaya çıktı. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

Çapraz bağlamayı doğal kütle spektrometresi ile birleştirmenin genel amacı, üç boyutlu düzenlemelerini aydınlatmaya yardımcı olan çok alt birimli protein düzenekleri hakkında tamamlayıcı yapısal bilgiler elde etmektir. Kimyasal çapraz bağlama ve doğal kütle spektrometresi, yapısal biyolojideki bileşim, bağlantı ve stokiyometri gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olur. Birkaç tekniği birleştirmenin temel avantajı, tek bir teknikle elde edilemeyen tamamlayıcı bilgilerin elde edilmesidir.İş akışımız diğer herhangi bir protein kompleksine uygulanabilir. Tuzlardan veya dokudan saflaştırılabilir veya saflaştırılmış proteinlerden yeniden oluşturulabilir. İlk olarak, istenen protein kompleksine 7.5 mikrolitre dört katlı basit tampon ve üç mikrolitre 10 katlı indirgeyici ajan uygulayın.Numuneyi yerçekiminin 16.200 katı hızla bir dakika aşağı döndürün. Santrifüjlemeden sonra, numuneyi 70 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Elektroforez için %4 ila %12 gradyanlı bir jel hazırlayın ve jeli elektroforez odasına yerleştirin.Önceden hazırlanmış çalışma tamponunu 20 kez su ile seyreltin ve elektroforez odasını doldurun. Ardından, iç hazneye 0,5 mililitre antioksijen ekleyin. Jelin ilk boşluğuna uygun bir protein markörü yükleyin ve protein örneklerini kalan boşluklara yerleştirin.Daha sonra, proteinleri 200 voltta uygun süre boyunca ayırın. Protein bantlarını lekelemek için jeli bir jel boyama kutusuna aktarın ve jeli su bazlı bir Coomassie daimi solüsyonu ile kaplayın. Jeli gece boyunca oda sıcaklığında yatay bir jel çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.Ertesi gün, leke solüsyonunu suyla değiştirerek jeli lekeden arındırın. Jel arka planı net görünene kadar önceki adımı yaklaşık üç ila beş kez tekrarlayın. Şimdi, mavi Coomassie boyası ile görselleştirilen protein bantlarını bir neşter kullanarak jellerden kesin.Protein bantlarını dikkatlice yaklaşık bir mililitrelik küçük parçalar halinde kesin. Daha sonra protein bantlarını su ve asetonitril ile yıkayın. DTT ile disülfid bağlarını azaltın ve ardından sistein kalıntılarını iyodoasetamid ile alkilleyin.Bunu takiben, proteinleri metin protokolünde tarif edildiği gibi tripsin ile sindirin. Peptitleri çıkarmak için, jel parçalarını amonyum bikarbonat ve asetonitril ile inkübe edin ve peptit içeren süpernatanı toplayın. Bunu takiben, jel parçalarını %5 formik asit ve asetonitril ile inkübe edin ve peptit içeren süpernatanı toplayın.Peptit içeren süpernatanı topladıktan sonra, her iki süpernatanı birleştirin ve çözücüleri bir vakum santrifüjünde buharlaştırarak ekstrakte edilen peptitleri kurutun. Peptitler kuruduktan sonra 20 mikrolitre %2 asetonitril ve %0.1 formik asit çözeltisi ile karıştırın. Peptitleri iki ila üç dakika boyunca bir sonikasyon banyosu ile çözün.Ardından, numuneyi 30 dakika boyunca yerçekiminin 16.200 katı sıcaklıkta bir santrifüjde döndürün. Numuneyi bir otomatik numune alma şişesine aktardıktan sonra, bir nano LC-MS/MS sistemine beş mikrolitre enjekte edin ve peptitleri çevrimiçi olarak tuzdan arındırmak ve konsantre etmek için peptit karışımını ters fazlı bir C18 ön sütununa yükleyin. Depolama tamponunu, bir dakika boyunca 1.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile boyut dışlama spin kolonundan çıkarın.Akışı attıktan sonra, 500 mikrolitre 200 milimolar amonyum asetat ekleyerek ve ardından santrifüjleme yaparak sütunu üç kez yıkayın. Santrifüjlemeyi takiben, 20 mikrolitre protein numunesini kolona yükleyin ve yerçekiminin 1.000 katı ve dört dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Şimdi, önceden hazırlanmış altın kaplı bir kılcal damarı bir kıl tutucuya yerleştirin.Bir iğnenin ucunu açın ve kılcal damarı bir ila dört mikrolitre protein örneği ile doldurun. Kılcal tutucuyu kütle spektrometresinin nano elektrosprey kaynağına bağlayın ve kılcal damarın ucunu koni deliğine 0,5 ila 1,5 santimetre mesafede konumlandırın. Püskürtmeyi başlatmak için saatte 80 ila 150 litre nano akışlı gaz kullanın ve sabit bir püskürtme sağlamak için gaz akışını ayarlayın.Q-TOF cihazının parametrelerini ve ayar sayfasını ayarlayın. Ardından, Al düğmesine tıklayarak edinimi başlatın ve iyi bir kütle spektrumu elde etmek için mümkün olduğunca çok taramayı birleştirin. 25 milimolar bir stok çözeltisi hazırlamak için 1.43 miligram BS3 ve 100 mikrolitre suyu çözün.Daha sonra, protein kompleksine BS3 ekleyin. Optimum çapraz bağlayıcı konsantrasyonunu belirlemek için değişen miktarlarda BS3 kullanın. Reaksiyon karışımlarını bir termomikserde bir saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.Şimdi, çapraz bağlı proteinlerin SDS sayfasını% dört ila% 12 gradyanlı bir jel ile gerçekleştirin. Jel bantlarını kesin ve daha önce tarif edildiği gibi jel içi sindirim ile proteini sindirin. Peptitleri jel içi sindirimden elde ettikten sonra, daha önce tarif edildiği gibi sıvı kromatografisine bağlı kütle spektrometresi gerçekleştirin.Heterododekamer RvB1/B2 ve heterooktamerik CPS komplekslerinin tüm protein alt birimleri yüksek güvenle tanımlandı. RvB1/RvB2'nin kütle spektrumu, heksamerik ve dodekamerik çift halkalara karşılık gelen iki türü ortaya çıkarır. RvB1/B2 kompleksi için bir kristal yapı, çift halkanın düzenini gösterir.BS3'ün RvB1/RvB2 kompleksine eklenmesi, proteinlerin kovalent bağlanmasına neden olur ve bu da daha yüksek moleküler ağırlıkta protein bantları ile sonuçlanır. Ve artan miktarlarda BS3, daha yüksek miktarlarda çapraz bağlı türler verirken, çapraz bağlı olmayan protein alt birimleri azalır. Çapraz bağlı dipeptit spektrumu, bu protein etkileşimini doğrulayan her iki peptidin Y iyon serisini gösterir.BS3 çapraz bağlamasından elde edilen sonuçlar, molekül içi etkileşimleri ve farklı alt birimler arasındaki etkileşimleri gösteren bir etkileşim ağında görselleştirilir. CPS'nin doğal kütle spektrumu heterodimer, heterotetramer ve heterooktameri gösterir. Tetramik ve oktamerik CPS'nin tandem kütle spektrometresi, küçük CPS alt biriminin ayrışmasını ortaya çıkarır.CPS'nin BS3 çapraz bağlayıcı ile kimyasal çapraz bağlanması, büyük CPS alt biriminin iki kopyası arasında birkaç molekül içi çapraz bağ gösterir. Kristal yapı, tetramik çekirdek ile periferik küçük alt birimler arasındaki etkileşim yüzeyinin çok küçük olduğunu ortaya koymaktadır, bu da alt birimler arası etkileşimlerin yokluğunu açıklayabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse iş akışımız bir hafta yapılabilir.Protein düzeneği çok karmaşık olduğundan, veri analizi için ek süre gereklidir. Bu prosedürü takiben, protein komplekslerinin üç boyutlu modellerini elde etmek için daha sonra hesaplamalı modelleme gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bu iki tamamlayıcı teknik protein düzeneklerinin yapılarını aydınlatmaya yardımcı olana kadar kimyasal çapraz bağlama ve doğal kütle spektrometresi deneylerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

combining-chemical-cross-linking-mass-spectrometry-intact-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kütle spektrometresi büyük protein kompleksleri ve analiz etmek için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntem, çok-altbirim meclislerinin bileşimi, stokiyometri ve genel mimari içgörüler sağlar. Burada, tarif, adım-adım yapısal bir kütle spektrometresi analizi gerçekleştirmek ve makromoleküler yapıları karakterize etmek için nasıl.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

İyon hareketliliği-kütle spektrometresi ve çarpışma kesiti ve kitle dayalı, iyonlar ayıran yeni ortaya çıkan bir gaz faz teknolojisi. Yöntemi protein komplekslerinin genel topoloji ve şekil üç boyutlu bilgi sağlar. Burada, araç ayarı ve optimizasyonu, sürüklenme kez kalibrasyon, ve verilerin yorumlanması için temel bir prosedürü anahat.

T-dalgası İyon Hareketlilik-Kütle Spektrometresi: Protein Karmaşık Analiz Temel Deneysel Prosedürler

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Kütle spektrometresi (MS) yapısı incelenmesi ve makromoleküllerin derlemeler dinamikleri için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Burada, protein kompleksi oluşumu ve ligand sorgulamaya MS tabanlı yaklaşımlar entegre.

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Burada, nasıl küçük açı X-Ray saçılma (SAXS) düşük çözünürlüklü zarflar makromoleküllerin yapıları temsil eden hakkında bilgi edinmek için kullanılması gereken mevcut. X-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans gibi yüksek çözünürlüklü yapısal teknikleri ile birlikte kullanıldığında, SAXS detaylı yorumlara çok etki alanlı proteinler ve makromoleküllerin kompleksleri çözüm sağlayabilir.

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Disulfide bağlantıları uzun birçok proteinlerin yapısını stabilize olduğu bilinmektedir. Bu bağlantıyla stabilize edilmiş multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem, SDS-PAGE analizinin azaltılması yoluyla yapılır. Burada, bu yöntem, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS dutpase nükleer izoformu analiz ederek gösterilmektedir.

Kültürde memeliler hücrelerinde Disulfide bağlantıları ile stabilize Multimeric kompleksleri algılamak için non-azaltma SDS-sayfa analizi ve kimyasal Crosslinking birleştiren

Yüksek çözünürlüklü complexome profilleme için mikrotom kullanan çok yönlü bir kriyoliking BN-MS protokolü sunulur.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Kütle spektrometrik tespiti ile dietilptirokarbonat bazlı kovalent etiketlemenin gerçekleştirilmesi için deneysel prosedürler açıklanmıştır. Dietilpyrokarbonat, solvent erişilebilir amino asit kalıntılarının değiştirilmesine yol açan, ilgi çekici protein veya protein kompleksi ile basitçe karıştırılır. Modifiye kalıntılar proteolitik sindirim ve sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi analizinden sonra tanımlanabilir.

Kütle Spektrometresi ile Protein Yüksek Sıralı Yapısını incelemek için Diethylpyrocarbonate ile Kovalent Etiketleme

Öğrenin, çok alt birimli protein komplekslerinin mimarisini açıklamak için kimyasal çapraz bağlama ve natif kütle spektrometrisi yöntemlerini nasıl birleştireceğinizi. Bu teknik, yapısal biyolojide temel sorulara yanıt verir.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme (Video) | JoVE Journal

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Daha fazla video keşfet