Kültürlü insan Fetal beyin sinir kök hücreleri Zika virüs enfeksiyonu Immunocytochemical analiz için

Bu in vitro prosedürün genel amacı, insan fetal nöral kök hücrelerinin farklılaşmasında Zika virüsü enfeksiyonunun sağkalım üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bu yöntem, viral enfeksiyonun doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini nasıl etkilediği ve bu değişikliklerin nöral kök hücrelerin hayatta kalmasına ve farklılaşmasına nasıl katkıda bulunduğu gibi nöral kök hücre ve bulaşıcı hastalık alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kullanılan hücrelerin insan olması ve genetik olarak değiştirilmemiş olmasıdır, bu da sonuçların translasyonel uygulamasını geliştirir.

Bu tekniğin etkileri, Zika virüsü ile ilişkili nörolojik defisitlerin tedavisine kadar uzanır, çünkü enfeksiyon mekanizmasını değerlendirmek ve terapötikleri taramak için bir araç sağlar. Kültür ortamını hazırladıktan ve insan nöral kök hücrelerini metin protokolüne göre kapladıktan sonra, inkübatörden geçilecek hücre şişesini alın ve biyogüvenlik kabinine veya BSC'ye getirin. Şişeyi yavaşça eğin ve hücrelerin havuzlanmış ortamın dibine batmasına izin verin.

10 mililitre ortamı, şartlandırılmış ortam için CM etiketli temiz bir 15 mililitrelik tüpe iki beş mililitrelik porsiyona aktarın. Şişeye yerleşen hücrelerin hiçbirini aspire etmemeye dikkat edin. CM tüpünden üç mililitre ortamı tripsin inhibitörü çözeltisi etiketli 15 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından CM tüpünü bir kenara koyun.

Daha sonra, T75 şişesinde kalan beş mililitre ortamı ve hücreleri çıkarın ve hücreler etiketli temiz bir 15 mililitrelik tüpe yerleştirin. Daha sonra, serolojik bir pipet ve 3.5 mililitrelik CM hacimleri kullanarak, T75 şişesini iki kez durulayın, CM durulamasını hücre tüpüne aktarın. Bu, tüm nöroküreleri T75 şişesinden çıkaracaktır.

Hücre tüpünü oda sıcaklığında 100 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Hücreler dönerken, 37 santigrat derece su banyosundan önceden hazırlanmış DPBS glikoz çözeltisini alın ve uygun miktarda tripsin ve DNaz ekleyin. Hücre tüpünün dönmesi durduktan sonra, şartlandırılmış tüm orta süpernatanı çıkarın ve CM tüpüne aktarın.

15 mililitrelik tüpteki hücre peletine tripsin çözeltisi ekleyin ve yaklaşık beş ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetlemek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Tüpün kapağını kapatın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosunda inkübe edin. Tripsin inhibitörü tüpüne, tripsin çözeltisi için kullanılanla aynı hacimde çözelti ekleyerek uygun hacimde tripsin inhibitörü ekleyin.

Ardından, tripsin inhibitörü çözeltisini ihtiyaç duyulana kadar 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. İnkübasyonun ardından, hücreleri beş ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, numuneyi 37 santigrat derece su banyosunda 10 ila 15 dakika daha inkübe edin.

Hücre inkübasyonunu takiben, küreler tamamen ayrılana kadar hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, hemen tripsin inhibitör çözeltisini ekleyin ve hücre süspansiyonunu 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Süspansiyondaki hücre sayısını saymak için, 15 mikrolitre Tripan Blue ön karışımını küçük bir tartım teknesine pipetleyin ve beş mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Karıştırmak için üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, 10 mikrolitre Tripan Mavi hücre süspansiyonunu bir cam lamel ile kaplı bir hemositometrenin her iki tarafına aktarın. Hücreleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin ve dört köşe ızgarasının her birindeki toplam hücre sayısını sayın.

Ardından, bu sayıları bir araya getirin. Metin protokolüne göre hücre sayısını hesapladıktan sonra, şişe başına beş kez 10 ila 6. hücre elde etmek için her bir T75 şişesine bir hacim hücre süspansiyonu ekleyin. Hacim beş mililitreden azsa, beş mililitreye kadar ek şartlandırılmış ortam ekleyin.

Ardından, şişeye büyüme faktörleri içeren 10 mililitre yeni DFHGFPS ortamı ekleyin. Şişenin hücre türü, tarihler, şişedeki hücre sayısı ve geçiş numarası ile etiketlendiğinden emin olun. İstenirse, hücreleri bu noktada inkübe edin.

Yapışan HNSC'leri plakalamak için, geçişten bir gün önce, BSC'yi metin protokolünde açıklandığı gibi temizleyin ve 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına tek steril 12 milimetre cam lamelleri yerleştirmek için forseps kullanın. Kuyucukları ve lamelleri steril suda %0.01 Poli-D-Lizin veya PDL kuyusu başına 250 mikrolitre ile kaplayın ve plakaları bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. PDL'yi kuyucuklardan çıkarın ve ardından bunları laminin DPBS'nin santimetre karesi başına bir mikrogram ile kaplayın.

Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün gerekmezse, Parafilmi kapatmak için plakanın kenarlarına sarın ve dört santigrat derecede saklayın. Fazla laminin çözeltisini aspirasyon yoluyla kuyulardan çıkarın ve kuyucukları bir kez durulamak için 0,5 mililitre DPBS kullanın.

Daha sonra, hücreleri her bir oyuğa 0,6 ila bir çarpı 10 ila 5. santimetre kare başına hücreler. Hücreleri metin protokolüne göre geçirdikten sonra, bir mililitre hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi beş dakika boyunca oda sıcaklığında 200 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı aspirasyon ile çıkarın.

Peletleri ZIKV stoğunda bir ile 10 arasında bir enfeksiyon çokluğunda veya MOI'de yeniden askıya alın. ZIKV çözeltisinin hacmi 0,5 mililitreyi geçmemelidir. Sahte tedavi için, ZIKV stoğunda kullanılan aynı hacim ve ortam tipindeki hücreleri yeniden askıya alın.

Numuneleri 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra, tüpü iki ila üç kez ters çevirin ve bir hücre peleti elde etmek için karışımı oda sıcaklığında 216 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspirasyonla çıkarın, ardından hücreleri durulamak için DPBS ile yeniden askıya alın.

Daha sonra, karışımı beş dakika boyunca 216 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı aspirasyon ile çıkarın. Hücreleri 12 mililitre uygun ortamla tekrar askıya alın. Ardından, enfekte olmuş hücrelerin 500 mikrolitresini 24 oyuklu bir plakaya yükleyin.

Burada görüldüğü gibi, sağlıklı küreler, yapışık olmayan nörokürelerden bir geçişi takiben dokuz ila 10 gün sonra, yaklaşık bir ila iki milimetre çapında olmalıdır. Sağlıklı küreler ayrıca yarı saydam görünecek ve kürenin kenarlarında psödokirimler gösterecektir. Farklılaşma ortamının yanı sıra uygun hazırlama adımlarını takiben, hücreler kültür kabının yüzeyi boyunca yayılacak ve bu şekilde gösterildiği gibi birbirine bağlı bir hücre tek tabakası olarak büyüyecektir.

Bu immünohistokimya deneyi, bir HNSC kültürünü doğrulamak için kullanılabilen, NSC'lerde yaygın olarak ifade edilen bir ara filament olan nestini tanımladı. Sınıf III beta-tubulin, glial fibriler asidik proteindeki veya GFAP'deki nöronların varlığını doğrulamak için burada etiketlenmiştir, farklılaşmayı takiben astrositlerin varlığını ortaya çıkarır. Spesifik ZIKV antikorları ile immünofloresan boyama, NSC'lerin K048 hattının hem Afrika hem de Asya ZIKV suşları tarafından enfekte olduğunu gösterdi.

Virüs, bir saatlik bir enfeksiyondan bir gün sonra enfekte olmuş bir hücrenin periferik bölgesinde kalma eğilimindedir, ancak tüm hücreyi üç ila yedi günde doldurur. Bir kez ustalaştıktan sonra, pasaj tekniği uygun şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir. Orta değişiklikler 20 dakika içinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, geçmeden önce nörokürelerin çok büyük olmadığından emin olmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, farmakoterapilerin Zika aracılı eksikliklerin önlenmesi veya tersine çevrilmesi üzerindeki etkinliği gibi ek soruları yanıtlamak için çeşitli ilaç tedavileri gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, bulaşıcı hastalık, bağımlılık ve travma gibi alanlardaki araştırmacıların virüslerin, kötüye kullanılan ilaçların ve travmatik fiziksel yaralanmaların insan nöral kök hücrelerini nasıl etkilediğini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, kendi araştırmalarınız için birincil insan fetal beyin nöral kök hücresini nasıl geçireceğinizi, enfekte edeceğinizi ve plakalayacağınızı, özellikle de en başarılı kültürü elde etmek için hücrelerin nasıl ele alınması gerektiğini iyi anlamış olmalısınız. Zika virüsü ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman çift eldiven gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.