Kemirgen tümör modelleri ilerlemesinde tümör izlemek için Imaging radyonüklid Floresans muhabir gen

Bu protokolün genel amacı, görüntüleme yoluyla canlı kemirgenlerde tümör büyümesini ve metastazı izlemektir. Bir radyonüklidfloresan füzyon raporlayıcısı, sonuçların ex vivo olarak doğrulanmasına yardımcı olan florofor ile pozitron emisyon tomografisi ile non-invaziv in vivo algılamaya izin verir. Bu yöntem, hücrelerin canlı hayvanlarda uzun bir süre boyunca izlenmesi gerektiğinde önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Uzak metastazın anlaşılmasına ve tedavilerin tümör ilerlemesi üzerindeki etkisine katkıda bulunabilir. Açıklanan teknik, otomatik sentez ile üretilen bir PET izleyici ile son derece hassas ve non-invaziv in vivo görüntüleme ile kanser hücresi takibidir. Geleneksel metodolojiye kıyasla hayvan kullanımında önemli bir azalma sağlar.

Bu yönteme yeni başlayan kişiler, karmaşıklığı karşısında bunalmış hissedebilirler. Özellikle, PET radyoizleyicinin otomatik sentezi bu işlemi önemli ölçüde basitleştirir. Bu yöntemin görsel gösteriminin, görüntüleme ile ilgili kritik adımların bu görünümlerini gösterdiğine inanıyoruz.

Bu tekniğin etkileri, kanser hücrelerinin yanında da izlenebilen yeni terapötiklerin klinik öncesi testlerine kadar uzanır. Bu yöntem, kanser biyolojisi ve tedavilerin geliştirilmesi hakkında fikir verebilir. Ne zaman in vivo lokalizasyon, yer değiştirme, genişleme ve belirli bir popülasyonun uzun vadeli izlenmesi ilgi çekicidir.

Başlamak için, raportör gen plazmitlerini kullanın, Lentivirus parçacıkları oluşturun, hücreleri dönüştürün ve bunları karakterize edin. Daha sonra, NISFP eksprese eden hücre hatlarındaki radyoizleyici alımı ile muhabir gen fonksiyonunu analiz edin. Saflaştırılmış hücreleri ve büyüme ortamını altı oyuklu plakaya tohumlayın ve tüm numunelerin üç nüsha halinde hazırlandığından emin olun.

Ertesi sabah, hücreleri serum içermeyen büyüme ortamı ile yıkayın ve plakaları 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede 50 kilo bekerel F18 tetrafloroborat ile inkübe edin. Daha sonra süpernatanı toplayın ve 100 mikrolitreyi önceden etiketlenmiş bir toplama tüpüne aktarın. Kalan süpernatanı atın, ardından hücreleri fizyolojik seviyelerde kalsiyum ve magnezyum içeren bir mililitre buz gibi soğuk PVS ile yıkayın.

Yıkama solüsyonunu toplayın ve 100 mikrolitre yıkama solüsyonunu önceden etiketlenmiş bir toplama tüpüne aktarın. Ardından yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın. Hücreleri kaldırmak için hem tripsin hem de EDTA içeren 500 mikrolitre PVS ekleyin.

Numuneleri, hücreler ayrılana kadar 37 santigrat derecede inkübe edin ve ayrılmayı kontrol etmek için bir mikroskop kullanın. Daha sonra hücre süspansiyonunu etiketli bir toplama tüpüne aktarın. Daha sonra, hücre örneklerini 250 G'de dört santigrat derecede dört dakika boyunca santrifüjleyin.

Dört numune türünün her birinden numuneleri saymak için otomatik bir gama sayacı kullanın ve birinci denklemi kullanarak alım yüzdesini elde edin. F18 tetrafloroborat sentezine başlamak için, otomatik radyo sentez platformunu uygun bir kimyasal başlıkta kurun ve doğru XML dosyasının kontrol bilgisayarına yüklendiğinden emin olun. Sentezleyici çalışırken, F18 tetrafuoroborate üretilecek ve daha sonra bir anyonik değişim kartuşu üzerinde saflaştırılacaktır.

Anyon değişim kartuşu su ile durulanacak ve daha sonra nitrojen gazı ile kurutulacaktır. Nihai ürün, bir mililitre %0.9 sodyum klorür ile anyon değişim kartuşundan alınır ve çıkış hattı üzerinden bir cam toplama şişesine aktarılır. Görüntülemeye başlamak için, fareleri yazılı protokole göre uyuşturun ve hazırlayın.

Daha sonra F18 tetrafloroborat çözeltisini 50 mikrolitre başına 5 megabekerele seyreltmek için steril% 0.9 salin kullanın. 100 mikrolitre F18 tetrafloroborat çözeltisi çekmek için hipodermik iğneli bir şırınga kullanın. Şırıngadaki radyoaktiviteyi ölçün ve ölçüm değerini ve zamanını kaydedin.

50 mikrolitre F18 tetrafloroborat solüsyonunu önceden ısıtılmış kuyruğa intravenöz olarak uygulayın. Daha sonra şırıngada kalan radyoaktiviteyi ölçün ve ölçüm değerini ve süresini kaydedin. Radyoizleyicinin kuyruk damarı enjeksiyonu kritiktir.

Yanlış enjeksiyon ve radyoizleyici dökülme riskini en aza indirmek için hayvan anestezisi altında gerçekleştiriyoruz. Hayvan, PET görüntü alımının başlangıcına kadar anestezi altında kalır. Radyoizleyici enjeksiyonundan tam olarak 45 dakika sonra.

Ardından, 45 dakikadan geri saymak için bir zamanlayıcı ayarlayın ve farenin masanın üzerine sternal konumda yerleştirildiğinden emin olun. Uygun cerrahi izleme aletlerini kurun ve devam etmeden önce aletlerin düzgün çalıştığından emin olun. Ardından, CT görüntüleme ve PET görüntü alımı için perametreleri ayarlayın.

Geri sayım sayacı 15 dakika okuduğunda CT görüntü alımına başlayın ve zamanlayıcı sıfır dakika okuduğunda PET görüntü alımına başlayın. İlk olarak, ötenazi yapılmış tüm farenin radyoaktivitesini ölçün ve ölçümün değerini ve zamanını kaydedin. Daha sonra fareleri inceleyin ve gerekli dokuları toplayın.

Kalan karkasın kuyruklu ve kuyruksuz radyoaktivitesini ölçün. Bu değerleri kaydedin ve ölçüm sürelerini not edin. Daha sonra, toplanan tüm dokuları ayrı ayrı tartın ve kanserli organların gün ışığı altında ve floresan ışığı altında fotoğraflarını çekin.

Ardından, aşağı akış histolojisi için dokuları OCT'ye gömün. Hasat edilen tüm dokuların radyoaktivitesini ölçün, değeri kaydedin ve ölçüm zamanını not edin. Son olarak, verileri ikinci denklemde açıklandığı gibi standart alım değerleri veya SUV olarak sunun.

Bu deneyde, bir kemirgen tümör modelinde tümör ilerlemesini izlemek için radyonüklid floresan kaydedici gen görüntüleme kullanıldı. Konfokal floresan mikroskobu, NISFP'lerin doğru plazma membran lokalizasyonunu gösterdi. NISFP fonksiyonu ve özgüllüğü, NIS tarafından sağlanan radyoizleyici tutulumu kullanılarak ölçüldü.

Benzer NIS ekspresyon seviyelerine sahip 4T1NISGFP ve 4T1NISRFP eksprese eden hücre hatları arasında anlamlı bir fark kaydedilmemiştir. Önemli olarak, preklorat bloğu, tüm hücre hatlarında, elde edilen radyoizleyici alımının spesifik NISFP ekspresyonuna bağlı olduğunu gösterdi. Tümör taşıyan hayvanların tüm vücut PET görüntülemesi, tümör progresyonu ve metastatik yayılım hakkında bilgi ortaya koydu.

Burada gösterilen örnek, akciğerde birkaç farklı nodül ile geniş uzun metastazı göstermektedir. Akciğerlerde enjekte edilen doz değerleri ve işgal edilen bireysel metastaz hacimleri değişmiştir. Bununla birlikte, hacim normalleştirilmiş yüzde enjekte edilen doz değerleri benzer bir aralıktaydı.

Çift modlu raportör genindeki floresan protein, hayvan diseksiyonu sırasında floresan ışığı altında kanserli doku tanımlamasını mümkün kıldı. Daha sonraki ex vivo radyoizleyici biyo dağıtımı, yüksek radyoizleyici alımına sahip organları ve dolayısıyla NIS eksprese eden dokuları ortaya çıkardı. Tiroid ve tükürük bezlerinin yanı sıra mide de doğal olarak NIS eksprese ederken, diğer tüm pozitif sinyaller tümör ve metastaz gibi kanserli dokuların göstergesidir.

Radyonüklid floresan raporlayıcı, aşağı akış doku bölümlerinde kanser hücresinin tanımlanmasını da sağlar. Bu teknik, kanser alanındaki araştırmacıların spontan metastaz sürecini görselleştirmelerinin ve ilaçların bunu nasıl etkilediğini test etmelerinin yolunu açtı. Bu prosedürü denerken, ilerideki tüm adımları dikkatli bir şekilde planlamak önemlidir.

Hücre hatları oluşturulmalı, hayvan tümör modelleri kurulmalı ve görüntüleme için tüm reaktifler ve ekipmanlar istenen günde mevcut olmalıdır. Başlamak için küçük pilot deneyler yapmanızı öneririz. Bir kez ustalaştıktan sonra, radyoizleyici üretimi ve in vivo hayvan görüntüleme, uygun şekilde yapılırsa sekiz saatlik bir iş gününde altı hayvanla yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, floresan proteini ile birleştirilmiş radyonüklid raportör NIS kullanılarak in vivo hücre takibi sağlanan bir raportör genine nasıl yaklaşılacağını iyi anlamış olmalısınız. Ayrıca, in vivo görüntüleme için gerekli PET radyoizleyiciyi üretmek ve dağıtım deneyleri ile in vivo ve ex vivo gerçekleştirmek için NISFP raportör eksprese eden hücre hatlarını karakterize edebilmelisiniz. Bu prosedürü takiben, ek soruları cevaplamak için florositometri gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

Örneğin, bir tümörün bağışıklık hücresi profilinin ve metastazının birbiriyle nasıl ilişkili olduğu veya zaman içinde nasıl değiştiği. Ürettiğiniz hücre dizilerinin mikroplazmit içermediğinden emin olmayı unutmayın, çünkü ikincisinin sonuçları etkilediği bildirilmiştir. Daha da önemlisi, radyoizotoplarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken kendinizi ve başkalarını korumaya her zaman öncelik verilmesi gerektiğini unutmayın.