Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Bu hücre kültürü protokolünün genel amacı, seruma maruz kalmadan korunabilen, gelişmekte olan veya yetişkin kemirgenlerden oldukça saf mikroglia kültürleri üretmektir. Bu prosedür, mikroglia morfolojisi, fibröz ketozis ve mikroglia'nın diğer CNS hücre tipleri ile etkileşimi ile ilgili sinirbilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokolün ana avantajı, mikroglianın her yaştaki kemirgen dokusundan hızlı bir şekilde izole edilebilmesi ve seruma maruz kalmadan kültürlenebilmesidir.

Beyni çıkarmak için, beyne zarar vermemeye dikkat ederek, oksipital kondili bir hayvanın omuriliğinden her iki taraftan diseksiyon makasıyla kesin. Daha sonra, kafatasının üst kısmı boyunca cildi kesin ve parietal ve frontal kemik boyunca burun kemiğine doğru bir tarafı kesin. Kafatasının üst kısmını forseps ile dikkatlice geri çekin, beyni hızlı bir şekilde çıkarın ve buz üzerinde önceden soğutulmuş DPBS'ye yerleştirin.

Kalan tüm hayvanlar için prosedürü tekrarlayın. Beyinler soğuk DPBS'de toplandıktan sonra, her bir beyni soğuk bir neşter bıçağıyla buz üzerinde bir petri kabında bir küp milimetrelik parçalar halinde doğrayın ve beş ila yedi mililitre buz gibi soğuk douncing tamponu ile buz gibi soğuk bir dounce homojenizatöre aktarın. Ardından, dokuyu 10 ila 20 yumuşak ve eksik vuruşla ayırmak için gevşek oturan bir dounce homojenizatör kullanın.

Homojenizatörün altındaki dokuyu doğrudan ezmemeye dikkat edin. Bunun yerine, dokuyu pistonun kenarları ile homojenizatör arasındaki boşluktan itin. Mikroglia canlılığını korumak için dokuyu birden fazla douncing turu ile yavaşça homojenize etmek önemlidir.

Daha sonra, hava kabarcıklarının girmesini önlemek için pistonu dikkatlice çıkarın. Kötü ayrışmış doku parçalarının homojenizatörün dibine çökmesine izin verin ve süpernatanı yeni, soğutulmuş, 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, çıkarılan hacmi yeni douncing tamponu ile değiştirin ve ayrışma prosedürünü toplam üç ila dört tur boyunca veya tüm doku ayrışana kadar tekrarlayın.

Bu prosedürde, hücre süspansiyonunu içeren 50 mililitrelik konik tüpe buz gibi soğuk douncing tamponu ekleyin ve toplam hacmi 33,5 mililitre olarak ayarlayın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna 10 mililitre MSB ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın. Bu, 43.5 mililitrelik bir hacimde% 23'lük bir nihai MSB konsantrasyonu ile sonuçlanacaktır.

Bundan sonra, hücreleri yavaş frenleme ile 4 santigrat derecede 500 x g'de 15 dakika santrifüjleyin. Ardından, miyelin ve döküntülerin üst tabakasını ve süpernatanı bir pipetle çıkarın. Mümkün olduğunca fazlasının çıkarıldığından emin olmak için üst tabakayı çıkarırken dikkatli olun.

Bunu takiben, hücre peletini 12 mililitre kaydırma tamponunda yeniden süspanse edin. Kalan hücre kümelerini parçalamak için hücre süspansiyonunu nazikçe ezin. Bu adımda, büyük kalıntıları veya hücre kümelerini çıkarmak için hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.

OX42 kaplı kaydırma kabını DPBS ile üç kez durulayın. Yıkamalar arasında plakanın tamamen kurumasına izin vermeyin. Son DPBS yıkamasını dökün ve filtrelenmiş hücre süspansiyonunu kaydırma kabına uygulayın.

Hücreleri dağıtmak için plakayı hafifçe döndürün. Ardından, hücrelerin yapışmasını sağlamak için plakayı oda sıcaklığında düz bir yüzeyde 20 dakika inkübe edin. 20 dakikadan daha uzun süre kuluçkaya yatırmayın, aksi takdirde hücrelerin tabaktan kurtarılması çok zorlaşır.

Daha sonra, yapışmayan hücreleri çıkarmak için kaydırma kabını DPBS ile 10 kez durulayın. Mikroglia plakaya sıkıca tutturulacaktır, bu nedenle diğer yapışmayan hücrelerin çıkarılmasını sağlamak için plakayı her durulamada döndürün. Son DPBS yıkamasını dökün ve 15 mililitre DPBS ve 200 mikrolitre tripsin ile değiştirin.

Hücreleri denemek için, tabağı 37 santigrat derecede 10 dakikaya eşit veya daha az bir süre inkübe edin. 10 dakikalık tripsinizasyondan sonra, mikroglia hala plakaya yapışacaktır. Karışımı dökün ve tripsini çıkarmak için plakayı DPBS ile iki kez hafifçe yıkayın.

Ardından, 12 mililitre buz gibi soğuk MGM ile değiştirin. Daha sonra, hücre ve substrat etkileşimini zayıflatmaya yardımcı olmak için kaydırma kabını iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin ve kaydırma kabının alanlarının kurumasını önlemek için kabın düz olduğundan emin olun. Bundan sonra, kaydırma kabından hücreleri kurtarmak için 10 mililitrelik bir pipet ve pipet kontrol cihazı ile yüksek hızda kuvvetlice pipetleyin.

Tüm hücreleri denemek ve çıkarmak için pipetten gelen sıvı akışıyla 16'ya 16'lık bir ızgara çizin. Genel hücre geri kazanımı ile kültürünüzün sağlığı arasında bir denge bulmak önemlidir. Hücre süpernatanının kaydırma kabına karşı tekrar tekrar pipetlenmesi, kültürünüzün canlılığının azalmasına neden olacaktır.

Plakadan ayrıldıklarından emin olmak için hücreleri 20x büyütmede mikroskop altında kontrol edin. Tabağın üst kısmında hücrelerin sıkıştığı noktaları işaretleyin ve bu alanlarda pipetlemeyi tekrarlayın. Hücre süspansiyonunu toplayın ve her 15 mililitrelik konik tüpe üç ila dört mililitre süpernatan tahsis edin.

Yavaş frenleme ile dört santigrat derecede 500 x g'de 15 dakika döndürün. 15 dakika sonra, süpernatanı aspire edin ve hücre peleti ile 0,5 mililitre MGM bırakın. Ardından, kalan MGM'deki her peleti yeniden süspanse edin ve hücreleri tüm tüplerden çekin.

Bunu takiben, hücreleri bir hemositometre ile sayın. Şimdi, 15 mikrolitre kollajen IV kaplamayı doğrudan 24 kuyulu anyonik kaplı bir doku kültürü plakasının ortasına yerleştirin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Hücreleri bir hemositometre ile saydıktan sonra, MGM'de mililitrede beşe 2.3 x 10'a seyreltin.

Kollajen IV noktasını aspire edin ve hemen bu noktaya 15 mikrolitre hücre süspansiyonu uygulayın, böylece nokta başına üç hücreye 3.5 x 10 verin. Daha sonra, hücrelerin yapışmasını sağlamak için 37 santigrat derecede beş ila on dakika inkübe edin. Ardından, kuyuya yavaşça 500 mikrolitre CO2 dengelenmiş TIC ekleyin.

Kapak kaymaları üzerine kaplama yapılıyorsa, önce steril cam kapak fişlerini mililitre PDL başına 10 mikrogram ile oda sıcaklığında bir saat su ile kaplayın. Daha sonra üç kez su ile yıkayın ve kapak fişleri üzerine nokta kaplama işlemine geçmeden önce UV ışığı altında bir kapüşonda kurumaya bırakın. Yüksek saflıkta mikroglia'nın başarılı bir şekilde izole edilmesini ve kültürünü göstermek için, P21 sıçanlarından mikroglia'yı izole ettik ve bu hücreleri sekiz gün boyunca% 10 FCS ile desteklenmiş TIC veya TIC'de kültürledik.

Hücreler daha sonra mikroglial belirteçler ve proliferasyon belirteçleri ile sabitlendi ve boyandı. TIC'de kültürlenen hücreler, dallanmış bir morfoloji, düşük proliferasyon seviyeleri ve mikroglia belirteçlerinin ekspresyonu gösterir. Karşılaştırıldığında,% 10 FCS ile takviye edilmiş TIC'de kültürlenen hücreler ayrıca mikroglial belirteçler için boyandı, ancak aktive edilmiş mikroglialarda sıklıkla görülen özellikler olan yüksek düzeyde proliferasyon ve amip morfolojisi gösterir.

Hücre belirteçleri için boyamaya ek olarak, yeni izole edilmiş hücreler üzerindeki RNA-Seq, hücrelerin RNA profilini değerlendirmek için güçlü ve hassas bir araç sağlayabilir ve kültürlerin başlangıç saflığını bilgilendirmeye yardımcı olabilir. CD11b mikropanlama tipik olarak, CD11b pozitif mikrogliaya ek olarak, CD11b pozitif nötrofillerin küçük bir yüzdesi ve monosit taşınması ile sonuçlanır. Bu hücreler birkaç gün sonra TIC'de ölecektir, ancak daha önceki zaman noktalarının analizini zorlaştırabilir.

İşte TIC'de 14 DIV'den sonra P21 sıçan mikroglia'nın hızlandırılmış bir filmi. İki hafta sonra, serumsuz kültürler, çanak boyunca hızlı proses uzantıları ve geri çekilmeler ile dinamik sürveyans davranışı gösterir. İşte fetal buzağı serumuna maruz kalmadan önce ve sonra TIC'de beş DIV'den sonra P21 sıçan mikrogliasının hızlandırılmış bir filmi.

Serum maruziyetinden sonra hızlı bir morfolojik değişiklik belirgindir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol uygun şekilde gerçekleştirilirse dört ila beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, mikroglia fonksiyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için fagositoz, kemotaksis, sağkalım, sitokin salınımı, uyaranlara transkripsiyonel yanıtları izlemek için diğer testler yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, mikroglia'yı yetişkin kemirgen dokusundan nasıl hızlı bir şekilde izole edeceğinizi ve serumsuz koşullar altında nasıl kültürleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.