Name: Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Öğrenin, gelişen veya yetişkin kemirgenlerden mikroglia izolasyonu ve serum içermeyen ortamda kültürü için bu hücre kültürü protokolünü. Bu yöntem, mikroglia morfolojisi ve MSS hücre etkileşimleri üzerine nörobilim araştırmalarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Christopher ve Dana Reeve Vakfı Uluslararası Araştırma Konsorsiyumu Medulla Spinalis Yaralanmalarında, Dr Miriam ve Sheldon G. Adelson tıbbi araştırma Vakfı, JPB Vakfı, Novartis temel Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenen, cömert katkıları Vincent ve Stella Coates ve Damon Runyon'un Kanser Araştırma Vakfı (DRG-2125-12).

Kemirgenler ilgili tüm yordamlar için ulusal ve devlet yasaları ve politikaları ile uyumlu Stanford Üniversitesi yönergeleri standartlarla uyumlu. Tüm hayvan yordamları laboratuar hayvan bakım Stanford Üniversitesi'nin Yönetim Panel tarafından kabul edildi.
Not: Tüm çözüm ve tampon besteleri Tablo malzemeleritemin edilmektedir.
1. CD11b Immunopanning (gün 0) için bir petri hazırlayın
Not: her 1-2 çocuk sıçan beyin yerine 1 immunopanning yemek hazırlamak.
<ol><li>25 mL 50 mM Tris pH 9,5 çözüm için 15 cm Petri kabına ekleyin.</li>
	<li>Keçi Anti-fare IgG (H + L zincirler) yemek 6 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Eşit dağıtmak için plaka girdap.</li>
	<li>Yemek için 1-3 h 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Durulama yemekleri üç kez ile DPBS++ (fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) Ca2 + ve Mg2 +ile), daha sonra 1 µg/mL OX42 antikor içeren arabellek kaydırma bir çözüm ile değiştirin. Gecede, oda sıcaklığında bulaşıkları düz bir yüzeye bırak.</li>
</ol>2. doku koleksiyonu (1 gün)
Not: Bu protokol ~ 3-4 h almalıdır.
<ol><li>Başlamadan önce tüm çözümler steril ve soğutulmuş buz üzerinde olduğundan emin olun. Tüm aletleri buz üzerinde sakin ve etanol ile kullanmak için önceden sterilize.</li>
	<li>Aşağıdaki uygun yasal prosedürleri, karbon dioksit boğulma tarafından bir çocuk laboratuvar sıçan kurban. Not: Alternatif olarak, ketamin/xylazine (100-200 µL 24 mg/mL ketamin bas, 2.4 mg/mL xylazine) öldürücü bir doz ile genç hayvanlar kurban. 14 günden daha az sürede hayvanlardır ketamin/xylazine kullanılmalıdır. Birden fazla hayvan kullanıyorsanız, bir hayvandan dokuya ayıklamak ve buz sonraki hayvanlar geçmeden önce önceden soğutulmuş DPBS++ yerleştirin.</li>
	<li>Bir hindpaw tutam ve devam etmeden önce hayvan tam yanıt vermeyi durdurma sorununu sağlamak.</li>
	<li>Transcardially buz gibi perfüzyon arabellek arabellek açık bitene 27½-G iğne kullanarak 10-30 mL hayvanla sıvı. Not: Perfüzyon arabellek hacmi hayvan boyutu/yaş bağlı olarak değişir.</li>
	<li>Hemen perfüzyon sonra hayvan başkanı kaldırın. Omurilik oksipital düzgün her iki tarafta diseksiyon makasla kesme gelen, beyin zarar vermemeye dikkat et. Kesmek sonra her tarafı dikkatle, Paryetal ve frontal kemik Burun kemiği doğru boyunca parça parça kesin. Forseps ile dikkatli bir şekilde geri kafatasının üst çekin, hızlı bir şekilde beyin (veya ilgi CNS yapıları) kaldırmak ve önceden soğutulmuş DPBS++ buzda yerleştirin.</li>
	<li>Tüm kalan hayvanlar için yineleyin. Not: Tüm devam etmeden adımları laminar akış başlıklı uygun steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.</li>
</ol>3. mekanik ayrışma (1 gün)
<ol><li>Tüm beyin topladıktan sonra bir beyin bir soğuk neşter bıçakla buzda Petri kabına 1 mm3 parçalar halinde doğrayın ve bir buz gibi dounce homogenizer 5-7 mL buz gibi douncing arabellek ile aktarın. Bir beyin bir zaman ayırmak.</li>
	<li>10-20 nazik ve eksik vuruş ile gevşek-montaj dounce homogenizer kullanarak doku ayırmak. Değil doğrudan homogenizer alt doku ezmek, ama bunun yerine doku piston kenarlarına ve homogenizer arasındaki boşluğu ile itmek için dikkat ediniz.</li>
	<li>Pistonlu Hava kabarcıkları giriş önlemek için dikkatli bir şekilde çıkarın. Kötü Disosiye doku parçaları homogenizer altına yerleşmek izin ve süpernatant bir yeni soğutulmuş 50 mL konik tüp için transfer.</li>
	<li>Kaldırılan birimin taze douncing arabellek ile değiştirin ve 3,2 3,3 için toplam 3-4 tur veya tüm doku ayrışmış kadar aygıtlarından. Her beyin için yordamı yineleyin.</li>
</ol>4. miyelin kaldırma (1 gün)
Not: Miyelin kaldırma microglia hayvanlardan P12 büyük yalıtım için kullanılır.
<ol><li>Hücre süspansiyon 25 mL pipet kullanarak 50 mL konik tüp hacmi ölçmek, sonra buz gibi douncing arabellek 33,5 ml toplam ses seviyesini ayarlamak için ekleyin.</li>
	<li>Miyelin ayrılık arabellek (MSB) 10 mL hücre süspansiyon için iyice tüp birkaç kez ters çevirme tarafından ekleyip karıştırın. Bu da % 23 bir son konsantrasyon MSB 43,5 mL hacminde yol açar.</li>
	<li>Hücreleri 500 x g yavaş frenleri 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi. Not: Santrifüj yaklaşık 1,5-2 yavaşlatmak için dakika sürer. Bu miyelin ve ölü hücre artıkları, biraz bulanık süpernatant ve canlı hücreler için zenginleştirilmiş bir daha küçük Pelet üst tabakası oluşturur.</li>
	<li>Miyelin/enkaz ve süpernatant bir pipet ile üst katmanı kaldırın. Daha bunun mümkün olduğunca kaldırılır olarak sağlamak için üst tabaka kaldırırken ilgilen.</li>
	<li>Hücre Pelet arabellek kaydırma 12 mL içinde resuspend. Yavaşça kalmış olabilecek hücreleri herhangi bir kümeleri kadar kırmak için hücre süspansiyon triturate.</li>
</ol>5. Immunopanning (1. gün)
<ol><li>Hücre süspansiyon büyük enkaz veya hücre kümeleri kaldırmak için 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.</li>
	<li>Üç kez DPBS++ile OX42 kaplı kaydırma çanak durulayın. Plakasına izin vermeyen yıkar arasında tamamen kuru.</li>
	<li>Son DPBS++ yıkama dökün ve filtre uygulanmış hücre süspansiyon kaydırma yemek için geçerlidir. Yavaşça hücreleri dağıtmak için plaka girdap, sonra plaka hücreleri bağlı kalmak izin vermek 20 dakika oda sıcaklığında düz bir yüzey üzerinde kuluçkaya. 20 dk daha uzun kuluçkaya değil veya hücreleri yemek kurtarmak çok zor olacak.</li>
	<li>DPBS++ ile kaydırma çanak yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için 10 kez yıkayın. Microglia-ecek var olmak sıkıca plaka bağlı, bu yüzden diğer yapışık olmayan hücreleri kaldırılmasını sağlamak için her durulama ile plaka girdap.</li>
	<li>Son DPBS++ yıkama dökün ve 15 mL DPBS++ ve 200 μL tripsin (%1.25 stok çözelti) adıyla değiştirin.</li>
	<li>Yemek için ≤10 min trypsinize için % 10 CO2 37 ° C'de kuluçkaya. Not: 10 dk daha uzun süre devam etmeyin veya microglia kaldırmak zor olacak.</li>
	<li>Trypsinization, 10 dakika sonra microglia hala plakasına kalmış olacak. 2 x tripsin kaldırmak, buz gibi microglia büyüme orta (MGM) 12 mL ile değiştirmek için DPBS++ ile nazikçe yıkayın ve tripsin/DPBS++ dökün.</li>
	<li>Hücre/substrat etkileşim zayıflatmak ve yemek emin olun yardım için tabak 2 min için buz üzerinde kaydırma kaydırma çanak alanlarında kurumasını önlemek için düz yerdir.</li>
	<li>Şiddetle kaydırma çanak hücreleri kurtarmak için bir 10 mL pipet ve damlalıklı denetleyicisinde yüksek hız ile pipet. 16 x 16 kılavuz sıvı akışı ile denemek ve tüm hücre kaldırma pipet çizin.</li>
	<li>Hücreleri tabaktan ayırdıktan emin olmak için 20 X büyütme, mikroskop altında hücreleri denetleyin. Mark noktalar nerede hücreleri hareketsiz şaşırıp kalmış yemeğin üstüne ve tekrar bu alanlarda pipetting.</li>
	<li>Hücre süspansiyon ve aliquot 3-4 mL başına 15 mL konik tüp süpernatant toplamak. 500 x g yavaş frenleri 4 ° c de 15 dakika çevir. Not: microglia küçük bir birim aracılığıyla iplik için hücre kurtarma maksimum sağlar.</li>
	<li>MGM 0.5 mL ile hücre Pelet bırakarak süpernatant, Aspire edin.</li>
	<li>Her Pelet içinde kalan MGM resuspend ve tüpler hücrelerden Havuzu.</li>
	<li>Hemasitometre içeren hücreleri saymak.</li>
	<li>Adım 6 - 7 uygulamaya bağlı olarak açıklandığı gibi plaka hücreleri.</li>
	<li>Kültür hücreleri 37 ° c % 10 CO2. Not: Hücreler kültür için ilâ 3-4 hafta düzenli medya değişikliklerle veya medya değişiklik ile bir hafta olabilir.</li>
</ol>6. spot doku kültürü plakaları/Coverslips (gün 1) kaplama
<ol><li>Kollajen IV kaplama doğrudan bir 24-şey Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü tabak merkezinde 15 µL plaka ( Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız) ve % 10 CO237 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.</li>
	<li>Hemasitometre hücrelerle sayım sonra 2.3 x 105/mL MGM hücrelere oranında seyreltin. Kollajen IV spot ve hemen plaka 15 µL hücre süspansiyon bu noktaya Aspire edin; Bu 3,5 x 103 hücreleri/spot verecektir. 5-10 dk 37 ° c % 10 CO2 hücreler uygun, TGF-B2/IL-34/kolesterol içeren büyüme orta (TIC) CO2-500 µL equilibrated eklemek izin vermek için hafifçe kuyuya kuluçkaya.</li>
	<li>Eğer coverslips, ilk kat steril cam coverslips ile 10 µg/mL manevra-D-lizin (PDL) H2O RT, 1 h için kaplama 3 kez H2ile O yıkama ve bir başlık UV ışık altında kurumaya bırakın. Coverslips üzerine spot kaplama coverslips kuru olduğunda, adım 6.2 içinde açıklandığı gibi devam edin.</li>
</ol>7. RNA/Protein izolasyon kaplama
<ol><li>104 hücreleri/iyi CO2 gün 1, bir 24-şey Anyonik/Katyonik tüm alan doku kültürü plaka kollajen IV kaplama ile kaplı ve için 10 dk - 1 h % 10 CO2, 37 ° C'de kuluçkaya sonra kaldırmak ve hemen 3-5 x plakası kat equilibrated TIC medya.</li>
	<li>2 günde bir % 50 medya değişiklik her biri için de bir gün sonra hazırlık yapmak. Ölü hücreleri iyi ortasında küme, bu yüzden oradan medya almak eğilimindedir.</li>
	<li>Kültürleri korumak için 2-3 günde bir % 50 medya değişiklik yapmak. Ortam değişikliğine kültürler için istenmeyen bir değişken varsa, hücreleri yaklaşık 1 hafta 3 hafta düzenli bakım ile karşı herhangi bir medya değişiklik olmadan hayatta kalamaz.</li>
</ol>

<ol><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li>
<li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li>
<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486(2015).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar araştırma potansiyel bir çatışması olarak yorumlanamaz herhangi bir ticari veya mali ilişkileri yokluğunda yapılmıştır bildirin.

Microglia sentinel bağışıklık hücreleri MSS gördükleri için çevresel değişiklikler oldukça tepkili olduklarını; Bu nedenle, büyük bir özenle hücrelerindeki inflamatuar yanıt onların izolasyon ve kültür8sırasında en aza indirmek için gereklidir. Bu hız ve sıcaklık bu protokolüyle içinde gerçekleştirilir. Böylece tüm Santrifüjü adımları 4 ° C'de gerçekleşmesi mümkün büyük ölçüde harekete geçirmek, azaltır zaman buz üzerinde veya 4 ° C'de hücreler tutmak, hayvanlar ile buz gibi perfüzyon tampon perio...

CNS parankimi makrofajlar microglia nöronal devreler ve gliyal sinyal ağları geniş bir dizi ile etkileşim. Geliştirme ve homeostasis sinaptik budama, apoptotik hücre Gümrükleme ve nöronal işlemleri1,2geçici etkileşimleri aracılığıyla beynin hayati rol oynarlar. Microglia nörolojik yaralanmaları, erken müdahale uzun, ince süreçlerinin lezyon siteler inflamatuar yanıt koordine etmek ve kanama3,4sınırlamak için uzanan vardır. Mikroglial morfoloji ve işlev değişiklikleri akut ve kronik CNS yaralanmaları her yerde vardır ve Morfoloji, Yerelleştirme ve hastalık Birleşik1çeşitli bir yelpazede inflamatuar aracılar ifade microglia sergi değişmiş. Nörodejeneratif hastalıklar için risk alter mutasyonlar kez ağırlıklı olarak veya sadece hastalık patogenezinde veya ilerleme5 microglia için kritik bir rol işaret olduğu gibi MSS microglia tarafından ifade edilir insan genetik çalışmalar göstermektedir . Yaralanma ve hastalık onların önem dikkate alındığında, mikroglial Biyoloji anlayışı sürdürmek yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için bir yüksek önceliktir.
Mikroglial Biyoloji anlayış için birçok kritik gelişmeler teknikleri ve kültür yöntemleri, gen ifade profilleri ve işlev tanımları da dahil olmak üzere diğer makrofaj nüfus çalışmalarda keşfetti mekanizmaları extrapolating tarafından ortaya çıktığı / morfolojik Birleşik. İşlevler genellikle oynamaya CNS manzara içinde şaşırtıcı şekilde makrofaj Genelleştirilmiş, microglia olmakla birlikte, kendilerini son derece uzmanlaşmış, ramified bir morfoloji ve onları diğer doku dışında setleri benzersiz gen ifade imza sergilenmesi makrofajlar6. Microglia--dan en diğer doku makrofajlar ayrı bir soy var; MSS ilkel hematopoiesis bir erken embriyonik dalga sırasında kolonize ve hayatı, bağımsız olarak kesin hematopoiesis7katkıları boyunca kendini yenilemek. Yetişkin microglia tam olgun gen ifade imza kadar ikinci doğum sonrası hafta8elde değil. Çevreleyen doku çevre ipuçları MSS sınırlı maruz kalma kan - beyin bariyerini9tarafından verilen kan kaynaklı faktörler içeren özel doku makrofaj özellikleri6, dikte içinde önemli bir rol oynamaktadır.
CNS homeostazı ve hastalığı mikroglial katkıları tam olarak anlamak için bir engel olduğunu olgun microglia görülen vivo içinde arıtılmış hücreleri ile özel özelliklerini recapitulating zorluk tüp bebek. İzole etmek için pek çok yöntem geliştirilmiştir ve kültür olduğu gibi microglia ama çoğu yaklaşımlar hücre survival desteklemek için serum güveniyor. Biz doğal olarak değişken bir reaktif biyoaktif molekülleri geniş bir dizi içeren, protozlar bir Morfoloji teşvik çünkü nükleer silahların yayılmasına karşı microglia ile çalışma artış özellikle sorunlu olduğunda, serum, bu ek göstermiştir ve microglia maruz kaldığında faktörlerin kan - beyin bariyerini bozulma sonra bulaşan kan için artan fagositoz9 vivo içinde sık görülen. Bu ölçümler tarafından serum Günese maruz kalan hücreleri microglia yaralanma veya hastalık durumlarında benzer ama tür değişiklikler azalır ne zaman microglia kültürlü CSF-1 (veya IL-34) içeren tanımlanmış büyüme orta, TGF-β, kolesterol ve selenit.
Bu iletişim kuralı Juvenil sıçan microglia kısa bir süre önce iş9' a ilgili serum-Alerjik koşullar altında kültür için ayrıntıları sağlar. Bu iletişim kuralı için rats postnatal gün 21-30 (P21 - P30) gelen aerodinamik ancak verim ve genel canlılığı türler ve hayvan yaş bağlı olarak değişir ama microglia sıçanlar ve fareler her yaştan itibaren yalıtmak için adapte edilebilir. Azami verimi ve biraz çocukça microglia kullanırken en iyi canlılık elde edilir (~ P9), verimleri ve yavaş yavaş biraz daha düşük seviyeleri yetişkin hayvanlarda sivrilen canlılığı ile. Microglia de fare ayrılmış olabilir ama biz fare hücreleri anlamlı olarak daha yüksek verimleri, canlılık ve ramified türleri Morfoloji, karmaşıklığı fare hücre kültürlerinde serum-Alerjik karşılaştırıldığında gösterir ki bulduk. Hayvanlar P50 daha büyük yaş bu iletişim kuralıyla değerlendirilmemiştir. Bu immunopanning yalıtım yordamı sırasında yalıtım mikroglial transkripsiyon profilleri değişiklikleri en aza indirmek için ve hücrelerin aşağı akım canlılığı en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir. Bu teknikleri ve medya formülasyonları kullanılarak, yüksek-canlılık birincil kültürler hafta boyunca sürekli olabilir. Bu koşullar altında kültürlü Microglia son derece ramified bir Morfoloji hızlı uzantısı ve geri çekme işlemleri içeren sergi ve nispeten düşük oranları yayılması. Biz serum-pozlama bu özellikler üzerinde önemini vurgulamak ve diğer yaklaşımlar göre bu yöntemin zayıf ve güçlü tartışıyorlar.

<table><tbody><tr><td>Sıçan: Sprague-Dawley</td><td>Charles River Kedi</td><td># 400</td><td></td></tr><tr><td>fare sıçan önleyici CD11b monoklonal (klon OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Kedi# MCA275R</td><td>Kaydırma: 1:1.000; Boyama: 1:500</td></tr><tr><td>Keçi polikolonal anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Kedi # AB5076</td><td>Boyama: 1:500</td></tr><tr><td>Tavşan poliklonal anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Kedi # AB15580</td><td>Boyama: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Eşek anti-fare 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # 11055</td><td>Boyama: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Eşek anti-keçi 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # A-21203</td><td>Boyama: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Eşek anti-Tavşan 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # A-31573</td><td>Boyama: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (ICC boyamada deterjan)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>Cat # 28313</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sülfat</td><td>Galen Laboratuvar Malzemeleri</td><td>Kedi # GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma & nbsp;</td><td>Kedi # M3149</td><td></td></tr><tr><td>Süt katılarından pepton</td><td>Sigma Cat</td><td># P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF -&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>Kedi # 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Murin IL-34</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Küçükbaş yünü kolesterol</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen IV</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Kedi # 354233</td><td></td></tr><tr><td>Oleik asit</td><td>Cayman Kimyasalları&nbsp;</td><td>Kedi # 90260</td><td></td></tr><tr><td>11 (Z) Eikosadienoik (Gondoik) Asit</td><td>Cayman Kimyasalları&nbsp;</td><td>Kedi # 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein boya</td><td>Invitrogen</td><td>Kedi # C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum homodimer-1</td><td>İnvitrojen</td><td>Kedi # E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Kedi # DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Sağlık</td><td>Kedi # 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma Kedi</td><td># T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>Kedi # 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>Kedi # 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Gibco</td><td>Kedi # 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-asetil sistein ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Kedi # A9165</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma Kedi</td><td># 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat # T1147</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum selenit</td><td>Sigma Cat</td><td># S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (yüksek glikoz)</td> <td>Gibco</td><td>Cat # 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Güney Biyoteknoloji Kedi</td><td># 0100-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A-003-E Primaria</td><td></td></tr><tr><td>Plakaları&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat # 62406-456</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı</td><td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td> Stok reaktifleri&nbsp; < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Apo-transferrin</td><td></td><td></td><td>Sulandırma: PBS 'de 10 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 100 Depolama: -20 / derece; C</td></tr><tr><td>N-asetil sistein</td><td></td><td></td><td>Sulandırma: H2O içinde 5 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 Depolama: -20 / derece; C</td></tr><tr><td>Sodyum selenit</td><td></td><td></td><td>Sulandırma: H2O içinde 2,5 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 25.000 Depolama: -20 derece; C</td></tr><tr><td>Kollajen IV</td><td></td><td></td><td>Sulandırma: 200 &mu; PBS cinsinden g/mL Kullanılan konsantrasyon: 1:100 Depolama: -80&derece; C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>Sulandırma: PBS içinde 2 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 Depolama: -20 / derece; C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Sulandırma: 200 &mu; PBS cinsinden g/mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 Depolama: -80 derece; C</td></tr><tr><td>Küçükbaş yünü kolesterol</td><td></td><td></td><td>Sulandırma: %100 etanol içinde 1,5 mg/mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 Depolama: -20 derece; C</td></tr><tr><td>Heparan sülfat</td><td></td><td></td><td>Sulandırma: H2O içinde 1 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 Depolama: -20 / derece; C</td></tr><tr><td>Oleik asit / Gondoik asit</td><td></td><td></td><td>Sulandırma: Gondoik: 0.001 mg / mL; Oleik:% 100 etanol içinde 0.1 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 1.000 Depolama: -20 derece; C</td></tr><tr><td>Heparin</td><td></td><td></td><td>Sulandırması: PBS içinde 50 mg / mL Kullanılan konsantrasyon: 1: 100 Depolama: -20 derece; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions&nbsp; </güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon Tamponu Tarifi</td><td></td><td></td><td>: 50 &mu; DPBS++'da g/mL heparin (Ca++ ve Mg+ + ile PBS) Yorumlar: Buz gibi soğukken kullanın</td></tr><tr><td>Douncing Buffer</td><td></td><td></td><td>Tarifi: 200 &mu; 50 mL DPBS++ içinde L %0,4 DNaseI Yorumlar: Buz gibi soğuk</td></tr><tr><td>Kaydırma Tamponu</td><td></td><td></td><td>Tarifi: DPBS++Microglia Growth Medium'da (MGM</td>)</tr><tr><td></td><td></td><td></td> süt katılarından 2 mg/mL pepton <td>Tarif: 100 birim/mL penisilin, 100 &mu içeren DMEM/F12; g/mL streptomisin, 2 mM glutamin, 5 & mu; g/mL N-asetil sistein, 5 &mu; g/mL insülin, 100 &mu; g/mL apo-transferrin ve 100 ng/mL sodyum selenit Yorumlar: Mikroglia'yı immnopanning kabından çıkarmak için buz gibi MGM kullanın.</td></tr><tr><td>Kollajen IV Kaplama</td><td></td><td></td><td>Tarifi: 2 &mu içeren MGM; g/mL kollajen IV</td></tr><tr><td>Miyelin Ayırma Tamponu</td><td></td><td></td><td>Tarifi: 9 mL Percoll PLUS, Ca++ ve Mg++ olmadan 1 mL 10x PBS, 9 &mu; L 1 M CaCl2, 5 & mu; L 1 M MgCl2 Yorumlar: Eklendikten sonra iyice karıştırın&nbsp; CaCl2 ve MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/Kolesterol içeren büyüme ortamı (TIC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tarif: İnsan 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murin IL-34, 1.5 & mu içeren MGM; g/mL küçükbaş yünü kolesterol, 10 &mu; g / mL heparan sülfat, 0.1 & mu; g / ml oleik asit ve 0.001 & mu; g/ml gondoik asit Yorumlar: 37 °C'ye ısıtılmış ortama kolesterol eklediğinizden emin olun; C ve 1.5 &mu'dan fazla eklemeyin; g / mL veya çökelir. Kolesterol içeren ortamları filtrelemeyin. Optimal pH'ı sağlamak için hücrelere eklemeden önce TIC ortamını 30 dakika - 1 saat boyunca% 10 CO2 ile dengeleyin.</td></tr></tbody></table>

yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen microglia kültürünü morfoloji serum-alerjik orta ramified

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia tüm merkezi sinir sistemi (MSS) hücreleri % 5-10'u temsil ve geliştirme, homeostasis ve hastalık sırasında önem onların katkıları nedeniyle giderek çizim. Makrofajlar ayrıntılı olarak incelenmiştir rağmen yıl, özel şekil-in microglia, MSS doku yerleşik makrofajlar, kısmen olgun mikroglial özetlemek için yetenek sınırlamaları nedeniyle büyük ölçüde gizemli kalmıştır Kültür özelliklerinde. Burada, saf microglia--dan olgun kemirgen beyin hızlı yalıtım için basit bir yordam gösterilmektedir. Biz de mikroglial canlılık yüksek düzeyde zaman içinde destek serum serbest kültür koşulları tanımlamak. Bu tanımlanan-orta koşullar altında kültürlü Microglia sergi ayrıntılı ramified süreçleri ve dinamik gözetim davranış. Biz kültürlü microglia serum maruz kalma bazı etkileri göstermek ve nasıl bu serum-Alerjik kültürler hem serum maruz kültürler gibi microglia içinde vivokarşılaştırmak tartışıyorlar.

Bu iletişim kuralı Juvenil sıçanlarından emir kültür yüksek saflıkta ramified microglia için bir yöntemi açıklar. Benzer sonuçlar olgunlaşmamış, perinatal ve Yetişkin Hayvanlar, kullanarak aşağıda anlatıldığı gibi alınabilir. Hücre izolasyonların genellikle ince nüanslar ve hücreleri ölmek için birçok fırsat içerir beri kalite kontrol denetim noktaları çeşitli adımlar başarı belirlemenize yardımcı olması için kullanılır. Genellikle birden çok adımda yalıtım Protokolü (<strong class="xfig"...

Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Bu hücre kültürü protokolünün genel amacı, seruma maruz kalmadan korunabilen, gelişmekte olan veya yetişkin kemirgenlerden oldukça saf mikroglia kültürleri üretmektir. Bu prosedür, mikroglia morfolojisi, fibröz ketozis ve mikroglia'nın diğer CNS hücre tipleri ile etkileşimi ile ilgili sinirbilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokolün ana avantajı, mikroglianın her yaştaki kemirgen dokusundan hızlı bir şekilde izole edilebilmesi ve seruma maruz kalmadan kültürlenebilmesidir.Beyni çıkarmak için, beyne zarar vermemeye dikkat ederek, oksipital kondili bir hayvanın omuriliğinden her iki taraftan diseksiyon makasıyla kesin. Daha sonra, kafatasının üst kısmı boyunca cildi kesin ve parietal ve frontal kemik boyunca burun kemiğine doğru bir tarafı kesin. Kafatasının üst kısmını forseps ile dikkatlice geri çekin, beyni hızlı bir şekilde çıkarın ve buz üzerinde önceden soğutulmuş DPBS'ye yerleştirin.Kalan tüm hayvanlar için prosedürü tekrarlayın. Beyinler soğuk DPBS'de toplandıktan sonra, her bir beyni soğuk bir neşter bıçağıyla buz üzerinde bir petri kabında bir küp milimetrelik parçalar halinde doğrayın ve beş ila yedi mililitre buz gibi soğuk douncing tamponu i

isolation-culture-rodent-microglia-to-promote-dynamic-ramified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Beynin hücresel heterojenite birincil mikroglia Yalıtımlı fizyolojik ve patolojik hem de kendi rolünü araştırmak için esastır. Bu protokol bir mekanik izolasyon ve yüksek verim ve yüksek saflıkta sağlar karışık hücre kültürü tekniği için geçerli birincil mikroglia hücreleri...

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Bu video, sıçan beyinlerinden mikroglia'yı izole etmek ve kültürlemek için bir yöntemi göstermektedir. Mikrogliaya özgü bir monoklonal antikor ile kaplanmış plakalar kullanılarak mikroglia'yı diğer nöronal ve nöronal olmayan hücrelerden ayırmayı gerektirir.

Sıçan Beyinlerinden Serumsuz Besiyeri Kullanılarak Mikroglia İzolasyonu ve Kültürü

Bu video, birincil sıçan nöronal kültüründen mikroglia'nın seçici olarak çıkarılması için bir tekniği göstermektedir. Serebellar granül nöronları, çoğalan glial hücreleri ortadan kaldırmak için bir antimetabolit ile tedavi edilir. Ek olarak, kültürden mikroglia'yı tüketmek için lizozom hedefleme ajanları ile tedavi edilirler.

Sıçan Serebellar Granül Nöron Kültüründen Mikroglia'nın Seçici Olarak Çıkarılması

Biz neonatal serebral korteks ve yetişkin omurilik canlı mikroglia verimli ve hızlı izolasyon / kültür yöntemleri özetlemektedir. Kortikal mikrogliya diseksiyonu ve kaplama ilk diseksiyonu sonrasında yer ~ 10 gün alarak sonraki mikrogliyal hasat ile, 90 dakika içinde yapılabilir.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Mikrogliyal biyoloji başarılı bir soruşturma için bir anahtar CNS dokudan izolasyonu sırasında ex vivo mikroglialardan immunofunction korunmasıdır. Flüoresan görüntüleme, bağışıklık kimyası ve proenflamatuar stimuli lipopolisakarit (LPS) ile Pam 3 CSK 4 (PAM) ile ELISA aşağıda mikroglia aktivasyonu ile değerlendirilen gibi son derece saf ve immunofunctional hücre kültürlerinde döner çalkalama sonuçları ile mikroglia izole edilmesi.

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Bu protokol, canlı, yetişkin, insan beyin dokusundan birincil mikroglia izole etkili, uygun maliyetli ve sağlam bir yöntemdir. İzole birincil insan mikroglia homeostaz ve hastalık hücresel süreçleri incelemek için bir araç olarak hizmet verebilir.

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Mikroglia, morfolojik ve fonksiyonel adaptasyon yeteneğine sahip, vücuttaki en çok yönlü hücrelerden biri olarak kabul edilir. Heterojenlikleri ve çok işlevlilikleri, beyin homeostazının korunmasını sağlarken, aynı zamanda çeşitli nörolojik patolojilerle de bağlantılıdır. Burada, omurilik mikrogliasını saflaştırmak için bir teknik açıklanmaktadır.

Fare omurilik mikrogliasının hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesi

Öğrenin, gelişen veya yetişkin kemirgenlerden mikroglia izolasyonu ve serum içermeyen ortamda kültürü için bu hücre kültürü protokolünü. Bu yöntem, mikroglia morfolojisi ve MSS hücre etkileşimleri üzerine nörobilim araştırmalarını destekler.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Daha fazla video keşfet