Electrochemiluminescence deneyleri için insan adacık otoantikorlar

Bu elektrokemilüminesans testinin genel amacı, otoimmün tip bir diyabette adacık atutoantikorlarını yüksek duyarlılık ve yüksek özgüllük ile tespit etmektir. Bu yöntem, adacık otoimmünitenin başlama zamanı ve tip bir diyabet için yüksek risk tahmini gibi tip bir diyabet alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, mevcut standart radyoanalizlere kıyasla daha hassas, daha hastalığa özgü ve radyoaktif olmamasıdır.

Bu tekniğin anlamı, tip bir diyabetin tahmin edilmesine ve teşhis edilmesine kadar uzanır, çünkü bu adacık otoantikorları semptomatik klinik hastalıktan aylar ila yıllar önce ortaya çıkar. Bu yöntem, tip bir diyabet için öngörü hakkında fikir verebilse de, çölyak hastalığı için transglutaminaz için otoantikorlar, TPO ve otoimmün tiroid hastalığı için tiroglobulin ve diğerleri gibi diğer otoimmün hastalıkları incelemek için de uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, tekniğin yüksek hassasiyet ve radyoaktivite olmamasına dayandığını bulduğumuzda aklımıza geldi.

Konvansiyonel ELISA yönteminin aksine, herhangi bir adacık otoantikoru tespiti için iyi çalışmamaktadır. Serum asit tedavisi ile insülin otoantikor testinin metin içinde tanımlanması zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Yong Gu olacak.

İlk olarak, insan adacık otoantijenini bir tüpte bir ila beş molar oranında biotin veya SULFO-TAG ile karıştırın. Ve her iki etiket de ışığa duyarlı olduğu için tüpü alüminyum folyo ile kaplayın. Ardından, tüpü oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Bu arada, inkübasyon devam ederken, spin kolonunu iki kat fosfat tamponlu salin ile astarlayın. Ardından, sütunu her seferinde iki dakika boyunca yerçekiminin 1.000 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Daha sonra, otoantijen etiket karışımını spin kolonunda iki dakika boyunca yerçekiminin 1.000 katı sıcaklıkta santrifüjleyin.

Ardından, etiketli antijeni alikot edin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, 96 oyuklu plaka başına üç mililitre antijen çözeltisi hazırlamak için antijen tamponu için dama tahtası testine dayalı olarak biotin SULFO-TAG etiketli antijenin rasyonel konsantrasyonunu kullanın. Daha sonra, her bir oyuğa dört mikrolitre serum ekleyin ve son hacmi bir kat fosfat tamponlu salin ile 20 mikrolitreye ayarlayın.

Ardından, her bir oyuğa 20 mikrolitre etiketli antijen çözeltisi ekleyin. Ve plakayı sızdırmazlık folyosu ile örtün, ışığı önleyin. Ardından, plakayı iki saat boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerine aktarın.

Çalkalayıcı durduğunda, plakayı buzdolabında 18 ila 24 saat boyunca dört santigrat derecede bırakın. Şimdi, her numune için 15 mikrolitre serumu 18 mikrolitre 0.5 molar asetik asit ile karıştırın ve aynı şekilde oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Dama tahtası tahlili temelinde, antijen çözeltisini hazırlamak için biyotin SULFO-TAG etiketli antijenin rasyonel konsantrasyonunu kullanın.

Ardından, yeni bir PCR plakasının her bir oyuğuna 35 mikrolitre antijen tamponu ekleyin. Serum karışımının inkübasyon süreci tamamlanmadan hemen önce, antijen plakası üzerindeki her bir oyuğun yanında, PH dokuzda 3.8 mikrolitre bir molar Tris tamponu ekleyin. İnkübasyon bittikten sonra, antijen plakasının her bir oyuğuna 25 mikrolitre asetik asitle muamele edilmiş serumu hızlı bir şekilde aktarın ve çözeltiyi çalkalayın.

Ardından, ışığı önlemek için PCR plakasını sızdırmazlık folyosu ile örtün ve iki saat boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bittiğinde, plakayı buzdolabında dört santigrat dereceye aktarın ve 18 ila 24 saat inkübe edin. Bir streptavidin plakasını buzdolabından dört santigrat derecede çıkarın ve plakanın oda sıcaklığına ulaşmasını bekleyin.

Streptavidin plakası oda sıcaklığına ulaştıktan sonra, her bir oyuğa 150 mikrolitre% 3 bloker A ekleyin ve PCR plakasını sızdırmazlık folyosu ile örtün ve gece boyunca buzdolabında inkübe edin. Ertesi gün streptavidin plakasını buzdolabından çıkarın ve tamponu kuyulardan çıkarın. Ardından, kalan tamponun ıslanması için plakayı bazı kağıt havluların üzerine baş aşağı koyarak kurulayın.

Ardından, art arda üç yıkama için kuyuyu yıkamak için 150 mikrolitre bir kat PBST tamponu ekleyin. Daha sonra, streptavidin plakasının her bir oyuğunda 30 mikrolitre serum antijeni inkübe edin ve ışığı önlemek için plakayı folyo ile örtün. Ardından, plakayı bir saat boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerine aktarın.

Bir saat sonra, serum antijenini plakadan inkübe edin ve kuyuyu üç kez yıkamak için 150 mikrolitre bir kat PBST tamponu ekleyin. Yıkama bittiğinde, bir plaka okuyucuda okumak için her bir oyuğa 150 mikrolitre okuma tamponu ekleyin. Bilinmeyen herhangi bir numuneyi analiz etmeden önce, her bir otoantikor testi için test sınırı, yaklaşık 100 tip bir diyabet hastası ve yaklaşık 100 sağlıklı kontrol test edilerek ayarlandı.

Daha sonra, en iyi duyarlılık ve özgüllüğü elde etmek için GADA testi için normalin üst sınırının optimal indeksi olan 0.023'ü belirlemek için bir ROC eğrisi çizildi. Daha sonra, bilinmeyen örneğin sonucu, yüksek pozitif, düşük pozitif ve negatif kontrol standartlarından türetilen bir denklem kullanılarak hesaplandı. Daha sonra, asit tedavisinin varlığında ve yokluğunda insülin monoklonal antikorunun normal insan serumu ile inkübe edilmesinde adacık otoatikor testinde elde edilen sinyalleri belirlemek için bir grafik çizildi.

Grafik, asit tedavisinin yokluğunda normal serumun eklenmesi üzerine sinyalin belirgin şekilde bloke edildiğini göstermektedir. Aksine, serum, insülin monoklonal antikoru ile inkübasyondan önce asit tedavisine tabi tutulduğunda elde edilen sinyal nispeten daha yüksektir. Asit tedavisinin varlığında ve yokluğunda yabancı hasta Sera kullanılarak elde edilen sinyalleri belirlemek için de benzer bir grafik çizildi.

Hasta Sera'nın antikor ile inkübasyondan önce asitle tedavi edilmesi, tedavi yokluğuna kıyasla adacık otoantikor testindeki sinyalleri önemli ölçüde artırır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde önceden oluşturulmuşsa, bir günde birkaç yüz numune için kolayca yapılabilir. Bu prosedürü denerken, test durumunu optimize etmek için her otoantikor testi için dama tahtası testini yapmayı unutmamak önemlidir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, otoimmün tip bir diyabet alanındaki araştırmacıların tahmin ve önleme için bir yol açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bu testin ne kadar kolay gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Serum örnekleriyle çalışmanın tehlikeli ve bulaşıcı olabileceğini unutmayın.

Bu işlem yapılırken her zaman doğrudan cilt temasından kaçınmak için önlemler alınmalıdır.