Hipokampal teta salınımlarını fareler davranışlar içinde Optogenetic sürüklenme

Bu yöntem, özel navigasyonda teta salınımının nedensel rolü ve ilgili davranışlar gibi nörofizyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, davranan farelerde hipokampal teta salınımlarının sıklığı ve düzenliliği üzerinde gerçek zamanlı bir kontrol sağlamasıdır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda eski bir yüksek lisans öğrencisi olan Dr.Franziska Bender olacak.

Stereotaksik çerçeveye sabitlenmiş tamamen anestezi uygulanmış fare ile başlayın. Medial septumun üzerinde bir delik açın. Enjeksiyon iğnesinin ucunu bir parça parafin filmi üzerindeki bir virüs damlasına batırın ve sıvının seviyesini gözlemlerken virüsü dakikada yaklaşık 500 nanolitre hızla dikkatlice çekin.

Enjeksiyon iğnesine hava girmesini önlemek için, virüs tamamen alınmadan önce çekilmeyi durdurun. İğneyi bir kağıt mendille temizleyin. Virüs ve yağın bir hava kabarcığı ile ayrıldığını kontrol edin ve tüp üzerindeki virüs seviyesini işaretleyin.

İğneyi kraniotominin üzerine yerleştirin ve ilk enjeksiyon noktasında yavaşça beyne yerleştirin. Dakikada 100 ila 150 nanolitre oranında 450 nanolitre virüs enjekte edin. Enjeksiyonu takiben 10 dakika bekleyin.

10 dakika sonra, iğneyi dikkatlice 0,1 milimetre yukarı hareket ettirin ve beş dakika daha bekleyin. Fiber hala fiber makaraya bağlıyken, çok modlu bir optik fiberden 125 mikrometre kaplamayı çıkarmak için bir mikro sıyırıcı kullanın. Ardından, elyafı yaklaşık iki ila üç santimetre uzunluğunda kesmek için bir elmas bıçak kullanın.

Optik fiberi, iç çapı 126 mikron olan bir zirkonya seramik çubuk yüksüğe yerleştirin. Fiberin yaklaşık 0,5 ila bir milimetresi, yüksüğün dışbükey tarafından çıkıntı yapmalıdır. Bir iğne kullanarak, yüksüğün her iki ucuna bir damla epoksi yapıştırıcı uygulayın, ancak yüksüğün yanlarına uygulamayın.

Kuruduktan sonra, yüksüğün dışbükey tarafını parlatmak için üç mikron tanecikli elmas alıştırma fiber parlatma filmi kullanın. Tungsten tel dizisini hazırlamak için, önce birkaç 100 mikron silika tüp kılavuzunu bir bant parçasının yapışkan tarafına yapıştırın. Ardından, formvar yalıtımlı 45 mikron tungsten telleri kılavuz tüplerden geçirmek için forseps kullanın.

Daha sonra, yaklaşık beş milimetre uzunluğunda altı emaye yalıtımlı ince bakır bağlayıcı telin her iki ucundan yalıtımı soymak için bir neşter kullanın. Ardından, yaklaşık iki ila üç santimetre uzunluğundaki bir topraklama kablosunun her iki ucundan yalıtımı soyun. Soyulmuş her kabloyu nano bağlantı pimlerine lehimleyin.

Her bir yapıştırma telini bir damla gümüş iletken boya kullanarak bir tungsten tele bağlayın. Kuruduktan sonra, bakır telleri kaplamak için az miktarda çimento uygulayın. Nano konektörün üst kısmına çimento uygulamaktan kaçının.

Çimentonun en az 30 dakika kurumasına izin verdikten sonra, tungsten tellerini beş ila 20 derecelik bir açıyla kesmek için kör paslanmaz çelik makas kullanın. Anestezi uygulanmış hayvanın temiz kafatasına 0,8 mm çapında dört delik açarak başlayın. Koronal sütürün üzerine rostral iki delik ve beyinciğin üzerinde iki delik açın.

Ardından, implantın topraklanması ve stabilizasyonu için paslanmaz çelik kemik vidalarını yerleştirin. Bakır bir tele bağlı topraklama vidasını beyinciğin üzerine yerleştirin. Elektrofizyolojik kayıtlar sırasında kas artefaktlarını önlemek için topraklama vidasını tamamen çimento ile örtün.

Tüm vidaları bağlayan bir kafes halkası oluşturun. İmplantasyon bölgesinin üzerinde bir kraniyotomi yapın, ardından beyin dokusunun yüzeyine yaklaşık bir mikrolitre steril salin uygulayın. Tel dizisini yavaşça kraniyotomiye indirmek için stereotax'ı kullanın.

Daha sonra beyin dokusunu korumak için implantasyon bölgesinin üzerine yaklaşık beş mikrolitre ılık sıvı balmumu uygulayın. Tel dizisinin etrafına çimento sürün ve kafatasını çimento ile örtün. Önceden lehimlenmiş topraklama kablosuna veya topraklama vidasına bağlı önceden lehimlenmiş tele bir damla akı uygulayın ve telleri bir lehimleme makinesi kullanarak sigortalayın.

Son olarak, tüm topraklama kablosunu çimento ile kaplayın. Yama kablosundan gelen ışık çıkışını kontrol edin. İmplante edilen fiberin iletim hızı %50 ise, yama kablosunun ucundaki ışık çıkışının 20 miliwatt olduğundan emin olun.

Kafa aşaması önünü bağlayınampimplante edilmiş konektöre ve fiber optik yama kablosunu optogenetik stimülasyon için implante edilmiş hipokampal fibere bağlayın. Ölçülen parametreler için uygun bir süre boyunca temel davranışı kaydedin. Uyaran üretecini kontrol etmek için yazılımı açın.

Dosyaya tıklayın, açın ve tercih ettiğiniz protokol dosyasını seçin. Işık stimülasyonunu başlatmak için indir'e tıklayın ve başlayın. Işık darbeleri ile teta ritminin kontrolünü gözlemleyin.

Spontan teta salınımları sırasında hipokampal lokal alan potansiyeli burada görülür. Fizyolojik teta ritminin bir göstergesi olan gama zarflarına dikkat edin. Optogenetik sürüklenme sırasında yedi hertz'de hipokampal yerel alan potansiyeli burada görülür.

Mavi çizgiler, ışık uygulamasının zaman pencerelerini gösterir. Burada bir okla gösterilen ışık darbesi ile faz sıfırlamasına dikkat edin. 10 hertz'deki hipokampal yerel alan potansiyeli, optogenetik sürüklenmeyi yansıtır.

Not: faz kilitli gama zarfları ve stratham orianlar ile stratum radiatum arasındaki faz tersine çevrilmesi de sürüklenme sırasında korunur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik dört saatlik deney süresinde ve ayrıca viral ekspresyon için altı haftada yapılabilir. Bu prosedürü denerken, verimli viral transdüksiyonu sağlamayı unutmamak önemlidir.

Optik fiber implantı yama kablosuna düzgün bir şekilde bağlayın ve iyi kalitede spontan yerel alan potansiyel teta salınımları elde edin.