Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

Bu yöntem, Drosophila beyin metabolizması ve glial hücrelerin aşırı çoğalmasının, diyet veya davranışın metabolizmayı değiştirip değiştirmediği, metabolik yeniden programlamayı nasıl etkilediği hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sinek beyinlerinin, bir seferde sadece bir beynin ölçülmesinden elde edilen tekrarlanabilir sonuçlarla tek bir bütün sağlam doku olarak metabolik olarak analiz edilebilmesidir. Bu yöntem sinek beyninin metabolizması hakkında bilgi sağlayabilse de, sırasıyla hayali diskler ve C.elegans gibi diğer dokulara ve model sistemlere de uygulanabilir.

Mikro doku kısıtlamalarını hazırlamak için, saklama kabından ölçülmekte olan beyin başına bir mikro doku kısıtlaması ve ayrıca yalnızca kısıtlama kontrolleri olarak kullanılmak üzere en az üç mikro doku kısıtlaması seçin. Bir örgü sepet ve altı oyuklu bir plaka kullanarak, kısıtlamaları yüzde yetmiş etanol ile durulayın ve her seferinde iki dakika boyunca üç kez deiyonize su ile yıkayın. Kısıtlamalar hala alkol kokusu yayıyorsa ek su yıkamaları yapın.

Mikro doku tutucuları tahlil ortamında yıkayın ve kullanıma hazır olana kadar solüsyon içinde bırakın. Drosophila melanogaster larva beynini incelemek için, kültürlenmiş Organ R sineklerinden oluşan bir şişeden geç üçüncü instar larvalarını seçin. Larvaları 500 mikrolitre 1x PBS içeren temiz bir diseksiyon spot plakasının kuyusuna yerleştirin.

Daha sonra larvaları kuyuda hafifçe çalkalayarak yıkayın ve başka bir temiz kuyuya aktarın. Ardından, spot plakayı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Larvaları bir cımbızla orta kısmından kavrayın, ikinci bir cımbızla göz kancalarını kavrayın.

İki cımbız seti kullanarak larvaları nazikçe ve pürüzsüz bir şekilde zıt yönlerde çekin. Tipik olarak göz kancalarına bağlı kalan ve genellikle ona bağlı göz anten disklerine sahip olan beyni görselleştirin. Beyni yerinde tutmak için göz kancalarını kullanarak, ek dokuları dikkatlice çıkarın.

Son olarak, göz kancalarını beyinden ayırın. Ardından, disseke edilmiş beyni 1x PBS içeren yeni bir kuyuya aktarmak için cımbız kullanın. Kesilen beyinleri 96 oyuklu bir metabolik tahlil plakasına eklemek için, önce deneysel, kontrol, yalnızca kısıtlama ve arka plan kuyuları dahil olmak üzere tüm kuyucuklara 50 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin.

Ardından, her bir oyuğa dikkatlice bir beyin yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, beyinleri kuyunun dibine bastırmak için bükülmüş iğneli bir mikroprob kullanın. Probu kullanarak beyinleri nazikçe yükseltilmiş üç kürenin ortasına yerleştirin.

96 oyuklu metabolik tahlil plakasına bir mikro doku tutucusu eklemek için önce kenara yerleştirin. Mikroskop altında, plastik halka aşağı bakacak ve ağ üstte olacak şekilde yönlendirin. Ardından, plakayı mikroskoptan çıkarın.

Her iki taraftaki kısıtlamayı kavramak için cımbız kullanın ve yavaşça kuyuya bırakın. Kısıtlamayı kuyuya bastırmak için bükülmüş iğneli bir mikroprob kullanın. Bu tekniğin anlamlı sonuçlar verebilmesi için mikro doku kısıtlamalarının her bir kuyucukta merkezlenmiş beyin üzerinde düzgün bir şekilde konumlandırılması gerekir.

Mikroskop altında, diseke edilen beynin doku kısıtlamasından görülebildiğini ve kuyuda ortalandığını doğrulayın ve tahlilde kullanılacak tüm kuyucuklar için prosedürü tekrarlayın. Deneysel, kontrol ve yalnızca kısıtlama kuyularının her birine dikkatlice 130 mikro litre tahlil ortamı ekleyin. Ortamı eklerken beyinlerin ve mikro doku kısıtlamalarının hareket etmediğini doğrulayın.

Ardından, arka plan kontrolü olarak kullanmak için dört köşe kuyucuğuna 180 mikro litre tahlil ortamı ekleyin. Bu prosedürde, yardımcı plakayı çıkarın ve kapaksız hücre plakasını aynı yönde metabolik analizöre ekleyin. Cihazın hücre plakasını alması ve tepsiyi kapatması ve ardından teste başlaması için Yük Hücresi Plakası"nı seçin.

Test tamamlandığında, çıkarılan hücre plakasını ve kartuşu çıkarın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, tahlil tamamlandıktan sonra beyinlerin ve mikro doku kısıtlamalarının kuyuya hala düzgün bir şekilde yerleştirildiğini doğrulayın ve anormallikleri olan kuyuları analizden çıkarın. Optimize edilmiş koşullar takip edildiğinde, larva ve yetişkin beyinleri ile yapılan tahliller, testin yaklaşık 25 dakikasında, stabilize edilmiş altıncı zaman noktasında dakikada 150 pikomolün biraz üzerinde OCR okumaları ile sonuçlanır.

Bu oran en az 30 dakika ve iki saate kadar korunur. ECAR, yetişkin beyinlerinde, altıncı zaman noktasında larva beyinlerine göre biraz daha düşüktür ve en az 30 dakika boyunca korunur. Bu bulgu, büyümeyi desteklemek için larva aşamalarında glikolizde bir artışa karşılık gelir.

Oligomisin gibi bir mitokondriyal inhibitör ile yapılan bir enjeksiyon, ATP'ye bağlı solunumu ortaya çıkarmak için OCR okumalarını düşürür ve Rotenon ve Antimisin A ile daha fazla tedavi, mitokondriyal olmayan oksijen tüketimini ortaya çıkarmak için OCR'yi düşürür. Bu prosedürü denerken, beyni merkezlemeyi hatırlamak ve testi çalıştırmadan önce ve analiz sırasında mikro doku kısıtlamasının yerine oturduğundan emin olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, gen ekspresyonunun gözlemlenen metabolik fenotipe nasıl katkıda bulunduğuna dair ek soruları yanıtlamak için kantitatif PCR ve western blot analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.