Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

Bu yöntem, ilaç keşfi ve HIV füzyonu için gerekli faktörlerin belirlenmesi gibi HIV giriş alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yüksek verimli tarama için ölçeklendirilebilmesidir. Bu teknik, HIV-1 yaşam döngüsünün erken aşamalarını hedefleyen ilaçları tanımlamak için büyük bileşik kütüphanelerini taramak için kullanılabilir.

Bu yöntem aynı zamanda insanlaştırılmış fareler gibi hayvan modellerinde HIV füzyon inhibitörlerini incelemek için de kullanılabilir. Araştırmacılar bulaşıcı HIV-1 ile biyogüvenlik önlemlerine uymalıdır. Bu, birden fazla turda çoğalmayan, ancak biyogüvenlik ofisiniz tarafından onaylanması gereken rekombinant tam uzunlukta bir viral klondur.

Bu işleme başlamak için, 500 mikrolitrelik bir Jurkat RG raportör hücresi şişesini 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirerek çözdürün. Hücreleri flakondan 10 mililitre RPMI tam ortama pipetleyin ve ardından karışımı 23 santigrat derecede beş dakika boyunca yerçekiminin 800 katı sıcaklıkta santrifüjleyin. Peleti 20 mililitre RPMI tam ortamda yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu bir T75 şişesine aktarın.

Şişeyi gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, şişedeki hücrelere mililitre başına 0.5 mikrogram Puromycin ekleyin. Mililitre başına 200.000 ila 800.000 hücre yoğunluğunu koruyan hücreleri kültürleyin.

Transfer tahlilinin kurulmasından bir gün önce, hücreleri mililitre başına 0.5 mikrogram Puromycin içeren taze RPMI ortamında mililitre başına 200.000 ila 400.000 hücreye bölün. Hücreleri gece boyunca büyütün. Donör hücreleri hücreden hücreye virüs bulaşmasına hazırlamak için, transdüksiyona uğramamış Jurkat hücrelerini çözün ve bunları mililitre başına 200.000 ila 800.000 hücre yoğunluğunu koruyarak 20 mililitre RPMI tam ortamlı bir T75 şişesinde kültürleyin.

7.500.000 hücreyi yerçekiminin 800 katı kuvvetle beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri ek olarak 120 mikrolitre Nükleofektör Çözeltisi V'de yeniden süspanse edin. Hücreleri bir elektroporasyon küvetine aktarın ve 4.5 mikrogram Gag-iCre DNA'sı ekleyin.

Hücreleri uygun bir program kullanarak elektropoze edin ve ardından hücreleri hemen% 10 FBS ile üç mililitre RPMI ortamına aktarın. Hücrelerin gece boyunca %5 CO2 ile 37 santigrat derecede inkübe ederek iyileşmesine izin verin. Ertesi sabah, iki mililitre Ficoll'u 15 mililitrelik konik bir tüpe pipetleyin.

Ficoll'un üstündeki altı oyuklu plakadan üç mililitre hücreyi yavaşça pipetleyin. Hücreleri 23 santigrat derecede beş dakika boyunca 800 kez yerçekiminde santrifüjleyin ve hücreleri arayüz Ficoll ortam arayüzünden altı oyuklu bir plakada üç mililitre RPMI tam ortama aktarın. Tahlil kurulumuna devam etmeden önce hücrelerin iki saat boyunca 37 santigrat derecede iyileşmesine izin verin.

Hem donörü hem de hedef hücreleri saymak için bir hemositometre kullanarak bu prosedürü başlatın. Daha sonra, hem donör hem de hedef hücrelerin test edilmesi için kuyu başına 50.000 hücreyi döndürün. Puromisin içermeyen RPMI tam ortamında mililitre başına 10 ila altıncı hücreye bir kez yeniden süspanse edin.

96 oyuklu bir plakada, her oyuğa 25 mikrolitre donör hücre süspansiyonu ekleyin. Başka bir 96 oyuklu plakada, oyuk başına 25 mikrolitre hedef hücre süspansiyonu ekleyin. Her bir oyuğa, uygun konsantrasyonda RPMI tam ortamında seyreltilmiş 25 mikrolitre test bileşiği ekleyin.

Donör ve hedef hücreleri bileşikle 30 dakika inkübe edin. 30 dakikalık ön işlemden sonra, bir plakanın içeriğini diğer plakaya pipetleyerek ve hücreleri 40 saat boyunca bir doku kültürü inkübatöründe inkübe ederek donör hücreleri hedef hücrelerle birleştirin. Hücreleri sabitlemek için, her bir oyuğa %2'lik bir nihai konsantrasyona kadar paraformaldehit ekleyinDaha sonra, hücreleri mCherry ve FITC kanallarına sahip bir akış sitometresinde analiz edin.

Ek olarak, GFP'ye özgü kanallarda 40X büyütmede floresan mikroskobu ile GFP sinyalini görselleştirin. Enfekte olmamış RG Jurkat hücreleri, çok güçlü bir RFP sinyali ile düşük düzeyde bir arka plan GFP sinyali sergiler. Gag-iCre ile hücresiz enfeksiyon, GFP sinyalinde bir artışa neden olur.

HIV-1 füzyon inhibitörünün varlığı, GFP sinyalinin gelişimini AMD3100 inhibe eder ve onu enfekte olmamış arka plan seviyelerine düşürür. Ters transkripsiyon inhibitörü AZT gibi bir füzyon sonrası olayın inhibitörü kullanıldığında, sinyal önemli ölçüde etkilenmez, bu da test tarafından üretilen GFP sinyalinin HIV-1 füzyonuna özgü olduğunu gösterir. Hücreden hücreye enfeksiyon testinde, RG Jurkat hücreleri, HIV-1 Gag-iCre ile transfekte edilmiş Jurkat hücreleri ile karıştırıldı.

AMD3100 ek olarak, seçici olmayan bir purinerjik inhibitör olan PPADS, 100 mikromolarda viral membran füzyonunu bloke etme yeteneği açısından test edildi. Sonuçlar, PPADS ile Gag-iCre füzyonunun doza bağlı bir inhibisyonunu göstermektedir. Bu prosedürü denerken, hücreleri hem virüs üretimi hem de enfeksiyon için üstel büyüme aralığında tutmak önemlidir.

Aşırı büyümüş hücrelerin kullanılması, bu testten elde edilen sinyalde dramatik bir azalmaya neden olacaktır. HIV ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman kurumunuz tarafından belirtilen BSL iki uygulaması yapılmalıdır.