Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme
October 18th, 2018
Biz bir in vivo serebral korteks yenidoğan farelerin görüntüleme için protokol Imaging iki fotonlu mevcut. Bu yöntem kortikal nöronlar, nöronal dinamikleri ve hastalık modelleri nöronal dinamiklerini değişiklikleri kontrol moleküler mekanizmaları gelişimsel dinamiklerini analiz etmek için uygundur.
Bu yöntem nörolojide anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, özellikle nöron soketi oluşumu ile ilgili olanlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, araştırmacıların yaşayan yenidoğan farelerde bireysel nöronların morfolojik değişikliklerini analiz edebiliyor olmasıdır. Doğum sonrası beş yavru ile anestezi ile başlayın ve kuyruk kıskaç testine bir reaksiyon yokluğunda devam edin.
İlk olarak,% 70 etanol ile silerek kafa derisi sterilize. Daha sonra, kafatası kapsayan derinin yaklaşık 20 milimetre kare kaldırmak için% 70 etanol ile sterilize makas kullanın. Sonra, steril forceps ve korteks tampon batırılmış temiz bir pamuklu bez kullanın, kafatası fasya kaldırmak için.
Görüntülenecek alan kaçınırken kanamayı durdurmak için damarsız cilt yüzeyine doku yapıştırıcısı uygulamak için bir yükleme ucu kullanın. Başka bir ısıtma yastığı üzerinde yavru yerleştirin, 37 santigrat derece ye ayarlanmış, ve anestezi kurtarmak için izin. Doku yapıştırıcısı kuruyana ve katılanına kadar yaklaşık 30 dakika bekleyin.
Doku yapıştırıcısı kuruduktan sonra, yeniden anestezili farenin kafatası penceresi hazırlığına başlayın. Kafatası üzerine korteks tampon bir damla uygulayın, sonra dikkatle kafatasının bir milimetre çapında alanı açmak için steril bir jilet kullanın, dura bozulmadan bırakarak. Beyin yüzeyini nemli tutmak için korteks tamponuyguluyor.
Herhangi bir kanamayı durdurmak için korteks tampon batırılmış jelatin sünger küçük bir parça kullanın. Kraniyotominin bir tarafını sıkıştırmak ve dura dokunmadan dural yüzeyden herhangi bir tampon ve kan drenaj için taze bir parça kullanın. Bu, açık pencere hazırlamak için en kritik adımdır.
Dura zarar görmeden olmalı ve fırça açıkta kalan duradan çıkarılmalıdır. Daha sonra, korteks tampon çözülmüş yüzde bir düşük erime agarose ince bir tabaka uygulamak için bir pipet ucu kullanın. Agarose jel tabakası üzerine yuvarlak, üç milimetrelik cam kapak kayma uygulayın.
Aralarında agarose jel fazla dökerek kapak kayma ve agarose jel tabakası arasındaki tüm kabarcıklar çıkarın. Fazla jelkaldırmak için cımbız kullanın, kapak kayma altından çıkıntılı. Çimento tozu ve çimento sıvıkarıştırın.
Katılaşmadan önce karışımı kafatasına uygulamak için bir pipet ucu kullanın. Sonra, diş çimentosu kullanarak kranial kemik için özel bir titanyum bar takın. Titanyum çubuğu hizalayın ve kapağı kolayca görüntü yakalamak için paralel olarak kaydırın.
Diş çimentosu ile maruz kafatası kapağı. Sonra, subkutan bir analjezik enjekte. Diş çimento katılaşmış kadar bir saat boyunca 37 derece santigrat ısı yastığı üzerinde bir kurtarma kafesi içinde yavru yerleştirin.
Görüntülemeye başlamak için, önce iki fotonlu lazer dalga boyunu ayarlayın. RFP uyarma için, 1000 nanometre dalga boyu kullanın. Kapak fişinin yüzeyini %70 etanol ile silin.
Anestenize yavruyu titanyum çubuğu kullanarak görüntüleme aşamasındaki titanyum plakaya takın. Başı ayarlamak için goniyometre aşamasını kullanın, kapak kayma nesnel lens paralel olduğunu gibi. 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma yastığı kullanarak görüntüleme sırasında yavrunun vücut sıcaklığını koruyun ve iki foton mikroskobunun 20x objektif lens altında görüntüleme aşamasını %0,7 ila %1'e düşürün.
Kapak fişinin üzerine bir damla su uygulayın. Yazılımı, Z-stack görüntülerini 1,4 mikron aralıklarla elde etmek için ayarlayın. Dördüncü katman nöron görüntüleme için, tüm dendritik morfolojiyi görüntülemek için Z genişliğini 150 ile 300 mikrona ayarlayın.
Nöronal morfolojiyi gösteren net görüntüler elde etmek için yavaş tarama ve ortalama kullanın. Genellikle tüm dendritik morfolojielde etmek için 20 dakikadan fazla sürer. Bu resim p5 yavrusu tabaka dört kortikal nöronlar temsili bir Z-yığın görüntü gösterir.
Ok analiz edilecek nöron gösterir. Bulanık dendritli nöronlar analizden çıkarılmalıdır. Bu görüntü, önceki görüntüde belirtilen nöronun daha yüksek büyütme görüntüsünü gösterir.
Mavi ok uçları bir sonraki zaman noktasında geri çekilecek dendritik ipuçlarını, küçük beyaz ok uçları ise komşu hücrenin aksonlarını gösterir. 4,5 saat sonra mavi ok başları ile dendritik ipuçları geri çekilir ve sarı ok başları ile dendritik ipuçları uzamış. Burada temsili bir dendritik morfoloji rekonstrüksiyonu gösterilmiş, burada görüldüğü gibi kopuk dendritleri gösteren nöronlar analizlerden dışlanmalıdır.
Bu yordamı çalışırken, işlem sırasında dura bozulmadan tutmak önemlidir. Bu prosedür kullanılarak, yenidoğan beyinde nöron aktivitesi paterni ile ilgili ek soruları cevaplamak için tahrik görüntüleme gibi diğer yöntemler yapılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, neonatal farelerin serebral korteksini incelemek için in vivo iki-foton görüntüleme protokolü sunmaktadır. Yöntem, araştırmacıların kortikal nöronların dinamiğini, moleküler mekanizmalarını ve hastalık modelleriyle ilişkili değişiklikleri analiz etmelerini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Kortikal nöronların gelişimsel dinamiğine odaklanır.
- Canlı neonatal farelerin in vivo görüntülemesinin gerçek zamanlı analizi sağlar.
- Nöron soket oluşumu ve genel nöronal dinamiklerle ilgili soruları ele alır.
Çalışmanın Amacı
- Sağlıklı ve hastalık durumlarında nöronal dinamikleri kontrol eden mekanizmaları anlamak.
- Zaman içinde nöronların morfolojik değişimleri hakkında bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Platform, in vivo iki-foton mikroskopisini içerir.
- Biyolojik model olarak post-natal beş gün sonrası yavrular kullanıldığı belirtilmiştir.
- Ana adımlar arasında kraniyotomy hazırlığı ve görüntüleme için bir kraniyal pencere uygulaması yer almaktadır.
- Görüntüleme, belirli aralıklarla Z-stack görüntülerinin yakalanması içerir.
Ana Sonuçlar
- Zamanla dinamik değişimleri gösteren, dendritik morfolojinin net görüntüleri elde edilmiştir.
- Dendritik uçların geri çekilmesi ve uzaması gibi nöronal tepkiler saatler içinde belgelenmiştir.
- Bulgular, prosedürler sırasında duranın sağlam kalmasının önemini göstermektedir.
Sonuçlar
- Bu protokol, nöronal gelişim ve dinamikleri yöneten süreçlere ilişkin detaylı bilgiler sağlar.
- Canlı nöronların morfolojik analizi yoluyla hastalık modellerini inceleme potansiyelini vurgular.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables real-time visualization of neuronal dynamics in living neonatal mice, supporting target validation in neurodevelopmental and neurodegenerative disease research. By capturing morphological changes in individual cortical neurons with high signal-to-noise ratio, it provides mechanistic insights that can de-risk early-stage target hypotheses. The approach bridges discovery neuroscience with translational applications in CNS drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by observing dendritic morphology changes in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Operational Value: Supports functional target validation through sparse and bright labeling of cortical neurons using the Supernova system.
- Predictive Value: Facilitates phenotypic screening of gene editing or RNAi effects on neuronal structure in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative Z-stack imaging data at 1.4 micron intervals to measure dendritic retraction and elongation over time.
- Operational Value: Establishes a reproducible surgical and imaging workflow for consistent neuronal morphology assessment across experimental conditions.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream evaluation of compound effects on neuronal dynamics in neonatal brain.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables analysis of developmental dynamics and molecular mechanisms controlling neuronal dynamics in disease models via CRISPR/Cas9 or RNAi integration.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by linking structural changes to functional neuronal outcomes.
- Risk Mitigation: Provides morphological readouts that help assess target engagement and mechanism-based effects prior to in vivo functional testing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and lead identification through structural phenotyping of neurons in a neonatal disease-relevant system.
- Discovery Biology: Enables direct observation of neuronal morphological changes to clarify pathway involvement and de-risk mechanistic assumptions.
- Screening: Delivers standardized, quantitative imaging outputs that allow comparison of neuronal dynamics across genetic or drug-treated conditions.
- Analytics: Produces time-lapse Z-stack data enabling measurement of dendritic tip retraction and elongation as phenotypic endpoints.
- Translational Research: Connects structural changes in cortical neurons to potential biomarker alignment in neurodevelopmental disorder models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal studies of neuronal development and degeneration across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by linking molecular interventions to observable structural changes in living neurons.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized cranial window preparation and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early structural phenotypes that predict functional neuronal outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on neuronal morphology validation in a physiologically relevant neonatal model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal mouse handling, stereotaxic surgery, and two-photon microscopy.
- Depends on specialized instrumentation including a two-photon laser system, goniometer stage, and titanium head bar.
- Necessitates cross-team standardization of surgical protocols and image analysis pipelines for consistent results.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different neuronal layers or brain regions beyond layer four cortex.
- Limited by the technical challenge of maintaining dura integrity and preventing brain motion during longitudinal imaging sessions.
