Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Biz bir in vivo serebral korteks yenidoğan farelerin görüntüleme için protokol Imaging iki fotonlu mevcut. Bu yöntem kortikal nöronlar, nöronal dinamikleri ve hastalık modelleri nöronal dinamiklerini değişiklikleri kontrol moleküler mekanizmaları gelişimsel dinamiklerini analiz etmek için uygundur.

Bu yöntem nörolojide anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, özellikle nöron soketi oluşumu ile ilgili olanlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, araştırmacıların yaşayan yenidoğan farelerde bireysel nöronların morfolojik değişikliklerini analiz edebiliyor olmasıdır. Doğum sonrası beş yavru ile anestezi ile başlayın ve kuyruk kıskaç testine bir reaksiyon yokluğunda devam edin.

İlk olarak,% 70 etanol ile silerek kafa derisi sterilize. Daha sonra, kafatası kapsayan derinin yaklaşık 20 milimetre kare kaldırmak için% 70 etanol ile sterilize makas kullanın. Sonra, steril forceps ve korteks tampon batırılmış temiz bir pamuklu bez kullanın, kafatası fasya kaldırmak için.

Görüntülenecek alan kaçınırken kanamayı durdurmak için damarsız cilt yüzeyine doku yapıştırıcısı uygulamak için bir yükleme ucu kullanın. Başka bir ısıtma yastığı üzerinde yavru yerleştirin, 37 santigrat derece ye ayarlanmış, ve anestezi kurtarmak için izin. Doku yapıştırıcısı kuruyana ve katılanına kadar yaklaşık 30 dakika bekleyin.

Doku yapıştırıcısı kuruduktan sonra, yeniden anestezili farenin kafatası penceresi hazırlığına başlayın. Kafatası üzerine korteks tampon bir damla uygulayın, sonra dikkatle kafatasının bir milimetre çapında alanı açmak için steril bir jilet kullanın, dura bozulmadan bırakarak. Beyin yüzeyini nemli tutmak için korteks tamponuyguluyor.

Herhangi bir kanamayı durdurmak için korteks tampon batırılmış jelatin sünger küçük bir parça kullanın. Kraniyotominin bir tarafını sıkıştırmak ve dura dokunmadan dural yüzeyden herhangi bir tampon ve kan drenaj için taze bir parça kullanın. Bu, açık pencere hazırlamak için en kritik adımdır.

Dura zarar görmeden olmalı ve fırça açıkta kalan duradan çıkarılmalıdır. Daha sonra, korteks tampon çözülmüş yüzde bir düşük erime agarose ince bir tabaka uygulamak için bir pipet ucu kullanın. Agarose jel tabakası üzerine yuvarlak, üç milimetrelik cam kapak kayma uygulayın.

Aralarında agarose jel fazla dökerek kapak kayma ve agarose jel tabakası arasındaki tüm kabarcıklar çıkarın. Fazla jelkaldırmak için cımbız kullanın, kapak kayma altından çıkıntılı. Çimento tozu ve çimento sıvıkarıştırın.

Katılaşmadan önce karışımı kafatasına uygulamak için bir pipet ucu kullanın. Sonra, diş çimentosu kullanarak kranial kemik için özel bir titanyum bar takın. Titanyum çubuğu hizalayın ve kapağı kolayca görüntü yakalamak için paralel olarak kaydırın.

Diş çimentosu ile maruz kafatası kapağı. Sonra, subkutan bir analjezik enjekte. Diş çimento katılaşmış kadar bir saat boyunca 37 derece santigrat ısı yastığı üzerinde bir kurtarma kafesi içinde yavru yerleştirin.

Görüntülemeye başlamak için, önce iki fotonlu lazer dalga boyunu ayarlayın. RFP uyarma için, 1000 nanometre dalga boyu kullanın. Kapak fişinin yüzeyini %70 etanol ile silin.

Anestenize yavruyu titanyum çubuğu kullanarak görüntüleme aşamasındaki titanyum plakaya takın. Başı ayarlamak için goniyometre aşamasını kullanın, kapak kayma nesnel lens paralel olduğunu gibi. 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma yastığı kullanarak görüntüleme sırasında yavrunun vücut sıcaklığını koruyun ve iki foton mikroskobunun 20x objektif lens altında görüntüleme aşamasını %0,7 ila %1'e düşürün.

Kapak fişinin üzerine bir damla su uygulayın. Yazılımı, Z-stack görüntülerini 1,4 mikron aralıklarla elde etmek için ayarlayın. Dördüncü katman nöron görüntüleme için, tüm dendritik morfolojiyi görüntülemek için Z genişliğini 150 ile 300 mikrona ayarlayın.

Nöronal morfolojiyi gösteren net görüntüler elde etmek için yavaş tarama ve ortalama kullanın. Genellikle tüm dendritik morfolojielde etmek için 20 dakikadan fazla sürer. Bu resim p5 yavrusu tabaka dört kortikal nöronlar temsili bir Z-yığın görüntü gösterir.

Ok analiz edilecek nöron gösterir. Bulanık dendritli nöronlar analizden çıkarılmalıdır. Bu görüntü, önceki görüntüde belirtilen nöronun daha yüksek büyütme görüntüsünü gösterir.

Mavi ok uçları bir sonraki zaman noktasında geri çekilecek dendritik ipuçlarını, küçük beyaz ok uçları ise komşu hücrenin aksonlarını gösterir. 4,5 saat sonra mavi ok başları ile dendritik ipuçları geri çekilir ve sarı ok başları ile dendritik ipuçları uzamış. Burada temsili bir dendritik morfoloji rekonstrüksiyonu gösterilmiş, burada görüldüğü gibi kopuk dendritleri gösteren nöronlar analizlerden dışlanmalıdır.

Bu yordamı çalışırken, işlem sırasında dura bozulmadan tutmak önemlidir. Bu prosedür kullanılarak, yenidoğan beyinde nöron aktivitesi paterni ile ilgili ek soruları cevaplamak için tahrik görüntüleme gibi diğer yöntemler yapılabilir.