Tasarım ve Reconfigurable DNA akordeon raf sentezi

Biz tasarım, simülasyon, ıslak-laboratuvar deneyleri ve analiz için 6 6 kafesleri reconfigurable bir DNA akordeon raf için detaylı iletişim kuralı tanımlamak.

Bu yöntem, DNA nano teknolojisi, nano moleküler devreler ve nano tıp gibi nano moleküller alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hem iki hem de üç boyutta periyodik olarak irate elementlerini kontrol etme kategorisini önemli ölçüde arttırmasıdır. Başlamak için, bir DNA akordeon rafı tasarlamak için Cadnano yazılımını indirin ve kurun.

Cadnano'yu açın ve kare kafesli yeni bir parça eklemek için kare aracına tıklayın. Kalem aracına tıklayın ve her bir kirişi Cadnano'nun sağ düzenleme paneline çizin. Bitişik kirişler arasındaki bağlantılar için kirişleri her 32 taban çiftinde bir kırın.

Zımba geçitlerini eklemlerle aynı konuma yerleştirin. Eklemlerin ek tek telli geçişlere sahip olmasını sağlamak için Cadnano'daki ekleme aracını ve kalem aracını kullanın. Şimdi, kesme aracını tıklayın.

Zımba tellerinin dairesel veya 60 baz çiftinden daha uzun olduğu telleri kırın. DNA kilit ipliklerini tasarlamak için kırma aracına tıklayın. Yapışkan bir parça yapmak için bir zımba DNA bölgesinin sekiz baz çiftini kırın ve bir zımba DNA bölgesinin sekiz baz çiftini silin.

Altıya altı akordeon rafında 18 yapışkan parça vardır. Kilit tellerinin her iki ucundaki yapışkan parçalara ters tamamlayıcı olan dizileri yerleştirin ve bunları, istenen uzunlukta poli T tellerden oluşan bir köprüleme bölgesi ile birleştirin. Yeniden yapılandırma için, iplik yer değiştirmesi için DNA kilitlerinin sonuna sekiz baz çifti ayak parmağı dizisi ekleyin.

Yeniden yapılandırma deneyi için DNA kilitlerine ters tamamlayıcı olan iplikler tasarlayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi OxDNA'yı kullanarak bir topoloji dosyası ve yapılandırma dosyası oluşturun. Topoloji dosyası, yapıda kaç tane iplik ve nükleotid olduğunu ve nükleotidler arasındaki omurga-omurga bağları ile ilgili bilgileri içerir.

Yapılandırma dosyası, zaman adımı, kutu boyutu ve enerji gibi genel bilgileri içerir. Konum vektörü, omurga taban vektörü, normal vektör, nükleotidlerin hızı ve açısal hızı gibi oryantasyon bilgileri de dahildir. Akordeon rafının gerçek yapısal bilgilerini yansıtmalarını sağlamak için topoloji ve konfigürasyon dosyasındaki bilgileri Cadnano'dan değiştirin.

Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi moleküler dinamik programını çalıştırın. Yapıları görselleştirmek için, OxDNA simülasyonundaki topoloji ve konfigürasyon dosyalarıyla Cogli programını çalıştırın. tuşuna basarak kutuyu gizleyin B.Tasarım DNA zımbalarını satın alın ve bunları metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın.

Metin protokolünde listelenen nihai konsantrasyonlarla 20 mikro litre karışık stok yapmak için kesikli DNA, magnezyum klorür çözeltisi, tris EDTA çözeltisi, nükleaz içermeyen su ve iskele DNA'sını birleştirin. Şimdi, karışık stok çözeltisini bir termal döngüleyicide hızla 80 santigrat dereceye ısıtın. Çözeltiyi, santigrat derece başına dört dakika oranında 60 santigrat dereceye soğutun.

Ardından, santigrat derece başına 60 dakika hızında 40 santigrat dereceden dört santigrat dereceye kadar soğutun. Yapıyı saflaştırmak için, sentezlenen yapının 20 mikro litresini 20 mikro litre çökeltme tamponunda karıştırın. Ardından, karışık stoğu 16.000 kez G ve dört santigrat derecede döndürün.

Süper natanı çıkarın ve peleti hedef tamponda çözün. Akordeon rafını serbest durumdan kilitli duruma yeniden yapılandırmak için, önce sentezlenen yapının 20 mikro litresine istenen uzunlukta iki mikro litre DNA kilit ipliği ekleyin. Numuneyi 50 santigrat derecede 100 dakika boyunca 30 dakika inkübe edin ve dakikada 0,33 santigrat derece hızında yavaşça 25 santigrat dereceye kadar soğutun.

Akordeon rafını kilitli bir durumdan serbest bir duruma yeniden yapılandırmak için, istenen uzunluktaki kilitli ipliklere ters tamamlayıcı olan iki mikro litre ipliği 20 mikrolitre sentezlenmiş yapıya ekleyin. Numuneyi 12, 60, 120 ve 240 dakika boyunca inkübe edin, numuneyi hızlı bir şekilde 40 santigrat dereceye ısıtın ve her birine karşılık gelen süre boyunca yavaşça 20 santigrat dereceye kadar soğutun. Ayırma adımından hemen sonra, istenmeyen denatürasyonu önlemek için numuneyi hızla dört santigrat dereceye kadar soğutun.

FRET analizi yapmak için, yapıyı daha önce olduğu gibi sentezleyin, floresan etiketli ipliklerle bekleyin. Saflaştırılmış numunenin konsantrasyonunu ölçün. Numuneyi 10 nano molar ile normalleştirdikten sonra, 384 kuyulu bir mikro plakadaki bir kuyuya 50 mikro litre yükleyin.

Numunenin floresansını donör ve alıcı boyalarla ve ayrıca 550 nano metrede heyecanlandırarak ve floresan spektrumunu bir florometre ile 570 nano metreden 800 nano metreye kadar ölçerek sadece donör numunesi ile ölçün. Alıcının konsantrasyonunu ölçmek için, numunenin boyalarını 650 nano metrede uyarın ve floresan spektrumunu 670 nano metreden 800 nanometreye kadar ölçün. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi FRET verimliliğini hesaplayın.

OxDNA'dan elde edilen bir simülasyon sonucu burada Cogli tarafından görselleştirilmiştir. Akordeon rafı, uzunlukları iki, sekiz, 13 ve 20 baz çifti olan DNA kilitleri ile gösterilmiştir. Altıya altı ağdan oluşan akordeon rafının açısı, DNA kilitlerinin uzunluğu tarafından kontrol edildi.

Akordeon rafının 18 kilitleme nişangahına iki, sekiz, 13 ve 20 baz çifti uzunluğunda DNA kilitleri ekleyerek, açı, temsili transmisyon elektron mikroskobu veya TEM görüntülerinde görüldüğü gibi yapılandırılır. Boya çifti, FRET verimlilik analizi için yapıya bağlanır. Burada, farklı DNA kilit uzunluklarına sahip yapılandırılmış altıya altı DNA akordeon rafının temsili TEM görüntüleri gösterilmektedir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, DNA nano teknolojisi alanındaki araştırmacıların, toplu olarak kontrol edilen bir sistemde farklı moleküllerin etkileşimlerini keşfetmelerinin yolunu açtı.