AMPA izlemek için bir yüksek-içerik tahlil reseptör ticareti

Burada birincil nöronal kültür hazırlığı ile uyumlu yüksek içerikli reseptör ticareti analizi gösteriyoruz. Bu yöntem, yüzeyi sabit nöronların inter mahzen reseptör havuzlarını ayrı ayrı etiketler. Normalleştirilmiş yüzey veya içselleştirilmiş reseptör yoğunluğunun reseptörün genel yoğunluğuna oranı olarak verilerin sunulmasını sağlamak.

Yüksek içerik ve reseptör ticareti talimi, çeşitli faktörlere yanıt olarak bir sinir ağı içindeki reseptör ticareti profillerindeki toplu değişiklikleri ölçmek için etkili bir araç sağlar. Alternatif yöntemlere göre çok daha az zaman ve malzeme tüketen. Kesintiler ve preceptors ticareti birden fazla nörolojik bozukluklar ile bağlantılı olmuştur, ve ilaç tedavisi için cazip bir hedef olarak kabul edilir.

Örnekler için çalışmalar Alzheimer hastalığının en erken belirtilerinden biri sinaptik kaybı ve azalmış sinaptik ve preceptor havuzları olduğunu göstermiştir. Bu teknik, zorluk değişen birçok farklı adımlar gerektirir. Özellikle 96 iyi plaka işleme ve kuyular manipüle deneyimi olmayan biri için zor kanıtlayabilir çünkü.

Ve denemenin sonuçları yanlış işlemeye karşı son derece hassas olduğundan, gerçekleştirilen çeşitli adımları görüntülemek yararlıdır. Eğitmen Başlamak için, her kuyudan önceden varolan ortamın 100 mikrolitre kaldırarak 96 kuyu plaka nöronlar beslemek. Ve 100 mikrolitre medyayla değiştirmek 37 santigrat dereceye kadar ısıtıldı.

Her üç ya da dört günde bir. Bir gün in vitro 14, her kuyudan 100 mikrolitre medya kaldırmak ve medya havuzu için bir multi-pipet kullanın. TTX'in dört mikromolar çözeltisini oluşturmak için havuzlu klimalı ortama bir mililitre TTX Stok çözeltisi iki mikrolitre ekleyin.

Her kuyudaki nöronları 100 mikrolitre dört mikromolar TTX çözeltisi ile tedavi edin. Yeterince havuzlu koşul ortamı yoksa, önceden depolanan ortamlardan bazılarını ekleyin. 4 saat boyunca 37 derecede %5'lik co2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yat.

Bundan sonra ortam içeren mevcut TTX çıkarın ve önceden ısıtılmış nöronal medya 200 mikrolitre ekleyin ve on beş dakika oda sıcaklığında mikro plaka kuluçka. Önce nöronal ortamı mikro plakadan çıkarın. Mikro plaka nın ilgili kuyularına anti gluA1 veya anti gluA2 antikor çözeltisinin elli mikrolitresini ekleyin.

İkincil antikor kontrol kuyuları için nöronal medya elli mikrolitre ekleyin. Antikor bağlanmasıiçin oda sıcaklığında yirmi dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra varolan ortam kuyulardan kaldırın.

Herhangi bir bağlı antikorları kaldırmak için mikro plakayı her kuyuda 100 mikrolitre oda sıcaklığında nöronal ortamla üç kez yıkayın. Sonra her kuyuya 100 mikrolitre 100 mikromDHPG stok çözeltisi ekleyin. %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yat.

Sonra DHPG çözeltisi kaldırmak ve her kuyuya nöronal medya 100 mikrolitre ekleyin. Bu işlemi ikinci kez yineleyin. Sonra %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 5 dakika kuluçkaya yat.

Deney günü%4 paraformaldehit ve %4 sakaroz NPBS çözeltisi hazırlayın. Her kuyudan medya çıkarın ve paraformaldehit ve sakaroz çözeltisi 100 mikrolitre ile değiştirin. Her ekleme zaman noktası için bu işlemi tekrarlayın.

Mikro plakayı 4 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra fiksatif kaldırın ve her kuyuya 100 mikrolitre DPBS ekleyin. DPBS'yi çıkarın ve her kuyuya 150 mikrolitre engelleme tamponu ekleyin.

Oda sıcaklığında doksan dakika kuluçkaya yat. Engelleme tamponunu çıkarın ve her kuyuya 50 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Tabağı ışıktan korurken oda sıcaklığında altmış dakika kuluçkaya yatın.

Antikor çözeltisini çıkarın ve her kuyuya 100 mikrolitre TBS ekleyin. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. TBS ekleyerek kuyulardan ortamı kaldırarak ve oda sıcaklığında dört kez daha kuluçkaya yatarak bu işlemi tekrarlayın.

Bundan sonra, mikro plaka tbs çıkarın. Her kuyuya PBS'de %4 paraformaldehit ve %4 sakaroz çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.

Paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve her kuyuya 100 mikrolitre TBS ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Önce % 2 saponin içeren TBS bir çözüm hazırlamak ve girdap kısaca saponin tozunu tamamen eritmek için çözüm.

2 mikrometrelik filtre kullanarak, otofloresansa neden olabilecek parçacıkları çıkarmak için çözeltiyi filtreleyin. Her kuyuya bu %2 saponin çözeltisinin 150 mikrolitresini ekleyin ve oda sıcaklığında on beş dakika kuluçkaya yatırın. Sonra saponin çözeltisini çıkarın ve her kuyuya 150 mikrolitre engelleme tamponu ekleyin.

Oda sıcaklığında doksan dakika kuluçkaya yat. Bundan sonra engelleme tampon u çıkarın ve her kuyuya ikincil antikor çözeltisinin elli mikrolitre ekleyin. Altmış dakika oda sıcaklığında kuluçka.

Daha sonra her kuyuya 100 mikrolitre TBS ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. TBS ekleyerek ve oda sıcaklığında dört kez daha kuluçka yada bu işlemi tekrarlayın. Bir kızılötesi lazer görüntüleme sistemi görüntü kullanarak 96 iyi mikro plaka üreticilerin talimatlarına göre.

Tarayın çözünürlüğünü 84 mikrometreye ayarlayın. Orta ve odak kullanılan 96 iyi mikro plaka taban yüksekliğine göre tofme tazyik. Image Studio menü düğmesine tıklayın, dijital medya için görüntü dışa aktarın ve TIFF formatında 300 dpi çözünürlüğe sahip görüntüleri dışa aktarın.

Görüntüyü ImageJ Fiji'de açın. Görüntü menüsüne tıklayarak renk kanallarını bölün ve ardından renkleri, kanalları böl. Sonra analiz, araçlar dan Yatırım Getirisi yöneticisi açın.

Daireleri sayılarla sınıflandırmak için YG yöneticisindeki etiketlerin kutusunu işaretleyin. 6 80 veya kırmızı kanalda, daire aracını seçerek ve ilk kuyuya doğru şekilde uyan bir daire çizerek ilgi çekici bölgeyi seçin. Ardından Ctrl artı T tuşuna basın ve daireyi bir sonraki kuyuya sürükleyin.

Tüm kuyular daire içine alana kadar bu işlemi tekrarlayın. YG yöneticisinden ölçü'ye tıklayın. Görünen değerleri seçin ve bunları bir elektronik sayfaya kopyalayın.

Sonraki yeşil kanala tıklayın ve seçilen ROI'ları görüntüye aktarın. YG yöneticisinden ölçü'ye tıklayın. Görünen değerleri seçin ve bunları bir elektronik sayfaya kopyalayın.

Bundan sonra metin protokolünde belirtildiği gibi yüzey reseptör ekspresyonu değişiklikleri hesaplamak. Bu işlemde ampa reseptör ticaretinin düzenlenmesinde arkın kalıcılığı yüksek içerikli ampa reseptör ticareti ve tsay kullanılarak incelenmiştir. Nöronlar etki potansiyellerini inhibe ve ark düzeylerini azaltır sodyum-iyon kanal bloker TTX ile tedavi edilir.

Ark çevirisi ve her yerde neden olan DHPG izledi. Apa reseptör alt ünitelerini içeren gluA1 ve gluA2 havuzları dhpg yıkamadan beş ve on beş dakika sonra ölçüldü. ArcKR nöronlar DHPG ile tedavi edildiğinde gluA1 endositoz artmış göstermek, iken tip nöronlar ile karşılaştırıldığında.

Nöronlar sadece TTX ile tedavi edildiğinde bu etki görülmez. gluA2 alt ünitesinin yüzey ekspresyonu wile tipi nöronlara göre kısa zaman noktalarında önemli ölçüde artırılır. Potansiyel bir alt birim değişimini gösteriyor.

Hücrelerin sıvı olmayan sabit paraformaldehit olduğundan emin olun deney günü taze olarak hazırlanmalıdır. Hücreler yüzey reseptörleri için etiketlendikten sonra yeniden sabitlenmelidir. Konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler nöronal yapı ve reseptör lokalizasyonunda daha fazla ilgili değişiklik karakterize tek hücreli çözünürlük sağlamak mümkün olacak.

MgluR aracılı LTD. Gelecek yönleriyanıt olarak ark alters ampa reseptörlerinin zamansal dinamikleri bozan diğer uyaranlara yanıt olarak ampa reseptörleri ticareti ölçmek olacaktır. Bu titrebelki diğer hücre tipleri, tedaviler ve reseptörlere uyarlanabilir, prosedür dikkatle ayarlanır ve uygun şekilde doğrulanmış olması koşuluyla.

Hücre yoğunluklarının, tedavi sürelerinin, fiksasyon adımlarının, permeabilizasyon adımlarının ve reaktif seçimlerinin ilgi sisteminizi optimize etmesini sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Denemenin başarılı ve verimli bir şekilde tamamlanması için DHPG solüsyonunun ve deney günü %4'lük paraformaldehit, %4 sakaroz çözeltisinin hazırlanması önemlidir. Gözlenen etkilerin tedaviye özgü olduğundan emin olmak için vakeel veya TTX ile iyi tedavi edilen kontrol gereklidir.

Spesifik olmayan bağlayıcılık la üretilen arka plan floresansını kontrol etmek için sadece ikincil antikorlarla tedavi edilen kuyuları da dahil etmek önemlidir.