İn vivo Iki renkli 2-foton görüntüleme genetiği etiketlenmiş Reporter hücrelerinin cilt içinde

Morfolojik değişiklikler, aktivasyon sonrasında bağışıklık duyarlı fibroblast hücrelerinde ortaya çıkar ve hücresel işe alma değişiklikleri teşvik. Genetik olarak tasarlanan fibroblast spesifik protein 1 (FSP1)-CRE ile birlikte 2-foton görüntülemenin kullanılması; tdtomato floxed-dur-floxed ^(TB/TB) fare hattı ve yeşil floresan etiketlenmiş lipopolisakkarid-fitc, biz dermal fibroblastlar ve morfolojik değişiklikler içinde lipopolisakkarid son derece spesifik alımı göstermek olabilir vivo.

Protokolümüz, floresan etiketli hücrelerin canlı bir hayvandaki inflamatuar periferik uyaranlara gerçek zamanlı olarak nasıl tepki verdiğini görselleştirmemizi sağlar. 2-Foton görüntüleme, canlı bir numunenin dokusunun derinliklerine görselleştirmeyi, hücrelerinin ve mikro çevrelerinin bütünlüğünü korumayı ve biyolojik sistemin doğru bir şekilde temsilini sağlar. Solunum zaman içinde pençe hareket eder, bulanıklık ve odak düzlemi kaybına neden.

Görüntülemeden önce pençeyi bantla sabit bir yüzeye sıkıca yapıştırdığından emin olun. Bu ilgi uygun düzlemi bulmak gerekir, objektif dokunmadan pençe yakın olduğundan emin olun ve enjeksiyon sitesi doğrudan üzerindedir. İşleme başlamadan önce, çoklu foton sistemini açın ve 25X öznel'i seçin.

Stereotaksik bir cihazı multi-foton mikroskobun sahnesine yerleştirin ve cihazı bir anestezi dağıtım makinesine bağlayın. Fare pençesi için bir bağlantı noktası olarak cihazın yüzeyine mat siyah kağıt bir parça yerleştirin. Rezonans tarayıcısını 512'ye 512 mikrometresabit bir tarayın alanıyla ayarlayın.

Uyarma lazerlerini sırasıyla yeşil ve kırmızı floresan protein sinyalleri için 930 ve 1, 100 nanometre uyarma dalga boylarına ayarlayın. Her iki uyarma lazerinin ışık yolunu tek hedefe yönlendirmek için 690'a 1, 050 nanometrelik bir dikroik ayna kullanın ve 930 nanometre ayarlı uyarma lazerinin ana tarayıcıya ve 1, 100 nanometre ayarlı lazerin doğrudan ana tarayıcıya geçmesini sağlar. Daha sonra FITC'nin lazer gücünü %5'e, yeşil floresan proteini ise %20'ye ayarlayın ve havai ışıkları kapatın.

Vivo görüntüleme için, fareanestezi ve metin protokolünde özetlenen. Anestezili faredeki parmak kıskacına yanıt eksikliğini onaylayın ve fareyi burun konisine erişene sahip stereotaksik cihaza yerleştirin. Siyah bant sıkıca ilgi alanına proksimal ve distal alanlarda siyah kağıt parçası namına arka pençe yapıştırmak için kullanın, pençe plantar yüzey engelsiz ve hedefe doğru bakan emin olun.

Pençenin plantar yüzeyine bol miktarda su bazlı yağ yerleştirin. Pençe ve amaç arasında sıvı bir sütun oluşturmak için yağlayıcı için objektif dokunun. Pençenin dermal tabakasına odaklanmak için FITC uyarma ışığını kullanın, tandem dimer Domates etiketli fibroblastların görselleştirilebileni doğrulayın.

Her iki lazer ile arka pençe plantar yüzeyinin hemen altında bulunan hücrelerin alanı görüntüleyin. Çevrenin temel gösterimini oluşturmak için dilim başına yaklaşık bir mikrometrede yaklaşık beş ila 10 Z diliminin 15 dakikalık zaman atlamasını elde edin. Temel görüntüleme elde edildiğinde, 20 mikrolitre PBS başına FITC konjuge lipolysaccharide veya LPS beş mikrogram ile 25 mikrolitrelik cam Hamilton şırınga yükleyin.

Pençe pozisyonunu bozmadan deneysel arka pati içine intraplantar enjeksiyon ile çözelti uygulayın. Daha sonra her iki lazer ile arka pençe plantar yüzeyinin hemen altında bulunan hücrelerin bir alan görüntü. LPS FITC'nin hücre aracılı intraplantar alımını belirlemek için dilim başına yaklaşık bir mikrometrede yaklaşık beş ila 10 Z diliminin 60 ila 120 dakikalık zaman atlamasını elde edin.

Dermal tabaka içindeki hücreler tarafından doğal bir floresan olmadığından, arka pençenin dermal tabakasındaki sayısız hücre, yaban tipi bir farede intraplantar enjeksiyondan sonra floresan etiketli LPS alarak gözlemlenebilir. LPS FITC enjeksiyonundan sonra, sadece fibroblast spesifik protein bir pozitif fibroblastlar reseptör dört bağlama ve bu hücreler tarafından ifade edilen bir tandem dimer Domates etiketi ile co-lokalizasyon yüksek düzeyde enjekte protein alımı gibi bilançosu ifade. Buna karşılık, reseptör dört gibi bilançosu olan fareler tüm vücuttan nakavt ve enjeksiyondan sonra LPS alımı yok.

Nitekim, hücre siluetleri ilaç hücrelerin etrafında interstisyel sıvı içinde dağıldığını belirten LPS FITC enjeksiyonu sonra görülebilir, ama aslında bir reseptör tarafından bağlı değildir. Bu protokolde hatırlanması gereken en önemli şey, hareket veya solunum nedeniyle videoda bozulma olmaması için pençenin hareketsiz kalmasını sağlamaktır. Bu prosedür kullanılarak, floresan etiketli hücrelerin yaralanma sonrası bir alana alınması ve bir hücrenin zaman içinde bir uyarıcıya verdiği yanıttaki morfolojik değişiklikler izlenebilir.

Yani 2-Foton görüntüleme araştırmacılar genetik muhabir fareler ve floresan etiketli bileşikler bir enjeksiyon dan sonra canlı bir hayvan ne olduğunu değerlendirmek için birleştirmek için izin verir.