Yetişkin zebrafish kalp çalışması için intratorasik enjeksiyon
14 Mayıs 2019
Bu yöntem, Yetişkin zebrafisinin toraks içine 0.5 − 3 μL solüsyonun enjekte edilmesine dayanır. Prosedür verimli organ zarar vermeden zebra balığı kalbin yakınlığı içine protein ve kimyasal bileşikler sunar. Yaklaşım, kalp çeşitli dokularda eksojen faktörlerin etkilerini test etmek için uygundur.
Yetişkin zebra balığı üzerinde kardiyak araştırma, ilaç tedavileri genellikle sistemik bir şekilde yapılır. İntratorasik enjeksiyon ile, bir lokal miyokardiyal hasara neden olmadan kalbe çözüm sunabilir. Bu yöntem, yetişkin bir zebra balığının kalbinin etrafında küçük hacimlerde ilaç, protein veya çözelti içinde diğer moleküllerin teslimine olanak sağlar.
Bu prosedüre başlamak için, mikroenjeksiyon uyarlanmış borosilikat cam kılcal çeker çekmek için bir iğne çekmece kullanın. Çekilen kılcal damarları, kil veya yapışkan bant modelleme rayları ile dokuz santimetrelik Petri kabında saklayın. Ortak makas kullanarak, sünger bir parça kesilmiş ve ortasında bir balık gibi siluet oymak.
Daha sonra, test edilmiş proteinler veya diğer bileşikler ile enjeksiyon çözeltileri küçük aliquots hazırlamak. %10 fenol kırmızısı ile tamamlanan 1x Hanks'in dengeli tuz çözeltisindeki maddeyi seyrelterek, töze bağlı olarak konsantrasyonlarını ayarlayın. Anestezilerin çalışma konsantrasyonu elde etmek için, balık suyu 100 mililitre içeren bir kabına triain stok çözeltisi iki ila üç mililitre ekleyin.
İlk olarak, stereo mikroskobu üstten gelen ışıkla açın ve büyütmeyi 16 x'e ayarlayın. Süngeri balık suyuyla ıslatın ve mikroskoptaki dokuz santimetrelik Petri kabının üzerine koyun. Odağı ayarlayın ve stereo mikroskop altında, metin protokolünün Şekil 1A'sında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi, tabanından yaklaşık yedi milimetre uzaklıktaki bir mikrokapillerın ucunu kesmek için iridektomi makasını kullanın.
Kesilmiş mikrokapilleri mikroenjektör cihazının iğne tutucuya yerleştirin. Microloader ipuçlarını kullanarak, uygun akışı elde etmek için enjeksiyon basıncını ayarlamak için bir kontrol çözeltisi yükleyin, sonra iğneyi boşaltın. Bundan sonra, enjeksiyon çözeltisinin seçilen hacmini kılcal damarın ucuna yükleyin ve hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
Yetişkin bir balık yakalamak için bir ağ kullanın ve anestezik çözelti içine aktarın. 1-2 dakika sonra, balık yüzmeyi bıraktığında ve operkülün hareketi azaldığında, herhangi bir temasa tepki vermemesi için balıklara plastik bir kaşıkla dokunun. Daha sonra, hızlı ve dikkatli bir şekilde ıslak sünger oluk içine balık aktarın, ventral tarafı yukarı ile.
Balığın başı operatörün baskın elinden uzağa işaret etmelidir. Stereo mikroskop altında, dikkatle balık derisi altında atan kalbin hareketini gözlemleyin. Görme atan kalp üzerinde enjeksiyon noktası belirlemek ve üçgenin ortasında, ventral kıkırdak plakaları tarafından tanımlanan.
Kılcal damar ucunu vücut eksenine göre 30 ila 45 derece arasında bir açıyla yerleştirin. Mikrokapillerin ucu yla cilde yavaşça nüfuz edin. İğne perikardın içine girdikten sonra, enjeksiyonu tamamlamak için mikroenjektör cihazının pedalına basın.
Enjeksiyondan sonra, kılcal damarı yavaşça torakstan çekin ve balığı hemen geri kazanım için sistem suyu olan bir tanka aktarın. Anesteziden tamamen iyileşene kadar balığı izleyin. Enjeksiyon etkilerini analiz etmek için, istenilen zaman noktasında kalp toplamak ve daha fazla analiz için hazırlamak.
Bu çalışmada, erişkin zebra balıklarında kalp üzerindeki etkilerini incelemek için eksojen bileşikler ve proteinler perikardiyal kaviteye teslim edilmektedir. Bu yöntemi doğrulamak için, ötanazi balıkiçine renk ve floresan boyalar enjekte ederek iki test deneyi yapılır. Her iki tahlilde, tam montaj analizi ventrikül de dahil olmak üzere tüm kalbin etiketleme ortaya koymaktadır, atriyum, ve bulbus arteriosus.
Bu sonuçlar, enjeksiyon çözeltilerinin kalp yüzeyinde verimli bir şekilde yayıldığını ortaya koymaktadır. İntratorasik enjeksiyonun kalp çalışmaları için intraperitoneal enjeksiyona karşı uygunluğunu karşılaştırmak için, benzer miktarda DAPI her iki yöntem kullanılarak enjekte edilir. Kalpler beş dakika veya 120 dakika sonra sabitlenir.
Her iki zaman da intraperitoneal enjeksiyondan sonra kalplerde DAPI pozitif hücre gözlenmez. Buna karşılık, intratorasik enjeksiyonlar miyokardiyumda DAPI etiketli çekirdeklerin varlığıile sonuçlanır. Bu sonuçlar intratorasik enjeksiyon kalbe bileşik teslimartırır göstermektedir, intraperitoneal enjeksiyon ile karşılaştırıldığında.
Kalp rejenerasyon çalışmaları için bu yöntemin uygunluğunu test etmek için, ventriküller kriyomlu, ve sonra enjeksiyonlar üç ve yedi gün post-kriyoyaralanma yapılır. Hem miyokardiyum hem de yaralı doku çok sayıda DAPI pozitif hücreler içerir, bozulmamış kalp ve fibrotik doku içine bu boya verimli bir penetrasyon gösteren. Ayrıca, enjekte phalloidin AF649 da peri-yaralanma bölgesikardiyomiyositler ve yaralı bölgenin bazı işe fibroblastlar tarafından dahil edilmiştir.
Bu deney, ilaçların epikardiyi geçerek altta yatan miyokardyuma nüfuz edebildiği ortaya çıkıyor. Boyalar kullanılarak intratorasik enjeksiyonların etkinliği test edildikten sonra, kalp üzerinde enjekte edilen proteinlerin etkileri analiz edilir. Bunun için eksojen sitokinin çeşitli süreçler üzerindeki etkileri araştırılır.
Kardiyomiyosit proliferasyonunun biyolojik yönleri, ekstrasellüler matriks birikimi, immün hücre alımı ve kardiyoprotektif gen ekspresyonu sitokin intratorasik enjeksiyonu ile aktive edilir. Bu sonuçlar intratorasik enjeksiyon çeşitli tahliller farklı kalp dokuları üzerindeki etkilerini incelemek için proteinlerin hedeflenen teslim için uygun bir strateji sağladığını göstermektedir. İğnenin perikard'a yerleştirilmesi başarılı bir enjeksiyon için önemli bir adımdır.
İğnenin şekli, penetrasyon açısı ve delinme bölgeleri iğne girişini etkileyen faktörlerdir. İntratorasik enjeksiyondan sonra veya öncesinde, enjekte edilen moleküllerin kalp yenilenmesi üzerindeki etkisini analiz etmek için kriyoinjury yapılabilir. İntratorasik enjeksiyon, zebra balıklarında kardiyak ön koşullanmayı incelemek için kullanıldı.
CNTF adı verilen bir protein enjekte edildi ve kalpteki sitoprotektif ve pro-rejeneratif programları geliştirdiği gösterilmiştir.
Genel Bakış
Bu çalışma, yetişkin zebra balıklarında intratorasik enjeksiyon için bir yöntem sunmakta, bu da proteinlerin ve bileşiklerin hedefe yönelik olarak kalbe teslim edilmesini sağlamaktadır. Teknik, geleneksel sistemik teslim yöntemlerine kıyasla geliştirilmiş verimlilik ve azaltılmış miyokardiyal hasarı göstermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Kardiyak araştırma
- Zebra balığı model sistemi
- İntratorasik enjeksiyon teknikleri
Arka Plan
- Standart ilaç teslim yöntemleri sistemik etkiler veya kalp hasarı ile sonuçlanabilir.
- Bu yöntem, çeşitli koşullar altında kalbi incelemek için lokalize bir yaklaşım sunar.
- Önceki çalışmalar, zebra balıklarında kalp çalışmaları için hedefe yönelik teslimat stratejilerinin eksikliğini göstermiştir.
Kullanılan Yöntemler
- Perikard boşluğuna bileşiklerin intratorasik enjeksiyonu
- Biyolojik sistem olarak yetişkin zebra balıkları
- Enjeksiyon ve kalp analizi için mikroskop kullanımı
Ana Sonuçlar
- Proteinlerin ve boyaların hasar görmeden kalbe başarılı bir şekilde teslim edilmesi.
- DAPI etiketlemesinde intratorasik enjeksiyonun intraperitoneal enjeksiyona kıyasla önemli ölçüde daha iyi sonuçlar gösterdiğini ortaya koydu.
- Miyokardiyumda etkili bileşik penetrasyonunun ve hücresel süreçler açısından tepkinin doğrulanması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, kardiyak fonksiyonları araştırmak için terapötik ajanların hedefe yönelik teslimini geliştirir.
- Kalp rejenerasyonu ve ön koşullandırma konularında biyolojik araştırmayı ilerletme potansiyeline sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Intrathoracic injection in adult zebrafish enables targeted delivery of proteins and compounds to the heart, supporting mechanistic de-risking in cardiac target validation. This method improves predictive confidence by allowing focal administration of test agents directly onto the heart surface, reducing systemic variability in preclinical assays. It provides a disease-relevant system for studying cardiac regeneration and preconditioning with enhanced translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by delivering exogenous factors directly to cardiac tissue.
- Operational Value: Supports functional target validation through precise compound delivery without myocardial damage.
- Predictive Value: Improves target confidence by demonstrating efficient penetration of injected substances into myocardium and underlying tissues.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming compound distribution across heart chambers.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through consistent pericardial delivery and quantitative readouts.
- Platform Utility: Facilitates screening readiness and scalability for evaluating protein and chemical compound effects on heart tissue.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant studies of cardiac preconditioning and regeneration in adult zebrafish.
- Mechanistic De-risking: Enables analysis of injected molecule effects on cardiomyocyte proliferation, extracellular matrix deposition, and immune cell recruitment post-injury.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides data to inform go/no-go decisions based on compound penetration and tissue-specific responses.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, enabling hypothesis testing and biological de-risking in cardiac research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by delivering test compounds directly to the heart.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, quantitative delivery of proteins and chemicals to cardiac tissue.
- Analytics: Enables comparison of conditions via measurable outcomes such as DAPI labeling, phalloidin incorporation, and cellular process activation.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation by modeling cardiac regeneration and preconditioning responses.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for localized compound delivery across multiple cardiac assays and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in cardiac pathway analysis.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of compound delivery to the zebrafish heart.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on direct heart tissue exposure data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, zebrafish handling, and microinjection techniques.
- Depends on specialized instrumentation including needle pullers, microinjectors, and stereo microscopes.
- Necessitates cross-team standardization of injection volumes, needle angles, and pericardial targeting.
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly for consistent epicardial penetration.
- Limited by the technical skill required to avoid myocardial damage during capillary insertion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:35
Tools and Solutions for Injections
1:30
Preparation of the Injection Station
2:28
Preparation of the Fish for Intrathoracic Injection
3:04
Microinjection into the Pericardium
4:07
Results: Validation and Analysis of the Intrathoracic Injection Method
6:35
Conclusion
