Akış Sitometrisi Kullanılarak İnsan Lökositler tarafından Aspergillus fumigatus Conidia Fagositozunun ölçülmesi

Bu protokol, insan lökositleri tarafından aspergillus fumigateurs Conidia etiketli fagositozisi, Conidia'nın hücrelere bağlanması ve akış sitometrisi ile etkileşim eksikliğini nicel olarak ölçteğin denli ölçülüdür. Bu yöntemin en büyük avantajı, çok sayıda hücrenin hızlı analizini kolaylaştırıyor olmasıdır. Buna ek olarak, hücre belirteçlerinin etiketlanması aynı örnek içinde nötrofiller ve monositlerin ayrı değerlendirilmesi sağlar.

Herhangi bir teknik Mucorales gibi diğer klinik ilgili mantarlar analiz etmek için kullanılabilir. Bunun yerine kırmızı kan hücreleri fagosit olarak kullanılabilir. Bu prosedüre başlamak için, dezenfektan ile bir kağıt havlu ıslak ve bir biyo güvenlik kabine yerleştirin.

Uçucu Conidia aşırı dağılımını önlemek için kağıt havlu üstüne yetiştirilen Aspergillus fumigatus bir tabak yerleştirin. Mantar Üstüne% 0.01 deterjan içeren PBS 10 mililitre ekleyin ve plaka üzerinde sıvı yaymak için bir Drigalski spatula kullanın ve koyu renkli Conidia ovmak. Conidia süspansiyonuna 30 mikrometrelik bir süzgeç le 50 mililitreye aktarın, bu da kalan miseli.

Plakaya deterjan ile pbs başka bir 10 mililitre ekleyin, bir spatula ile yayıldı, ve süzgeç aracılığıyla aynı tüpe aktarın. Daha sonra PBS'de çözünmüş 0,1 molar sodyum karbonatiçeren steril bir çözelti hazırlayın. Ve bu sodyum karbonat çözeltisinde FITC tozundan 0.1 milimolar çözelti hazırlayın.

15 mililitrelik bir tüpte, bu FITC çözeltisinin beş mililitresinde 100 milyon veya daha az Conidia'yı yeniden askıya alın. 37 derecede 20 dakika boyunca bir rotatörde kuluçkaya yat. Conidia'ya kadar şişmek için, %10 FCS ile desteklenen beş mililitre RPMI orta sında Conidia etiketli FITC'yi yeniden askıya alın.

Ve istenilen süre boyunca 37 santigrat derecede bir rotatörde kuluçkaya yat. Bir biyo güvenlik kabininde, 50 mililitrelik bir tüp içine beş mililitre buffy ceket yerleştirin. Tüpü EL tamponuyla doldurun ve üç kez ters çevirin.

Karışımın sütlü görünümü netleşene kadar, beş ila sekiz dakika boyunca yatay olarak kuluçkaya yatırın. Sonra, 300 kez G santrifüj ve 10 dakika oda sıcaklığında. Supernatant atın ve pipetting tarafından EL tampon bir mililitre pelet resuspend.

24 mililitre daha EL tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin. Santrifüj 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika. Supernatant atın ve RPMI medya bir mililitre hücreleri resuspend, ile birlikte 10%FCS.

Başlamak için, 1.5 mililitre RPMI içinde iki milyon lökosit ve dört milyon FITC etiketli Conidia transferi 10% FCS ile takviye, bir 12-iyi kültür plakası. Yalnızca Conidia içermeyen hücrelerin denetimini ve etiketlenmemiş Conidia'ya sahip hücrelerin denetimini ekleyin. Plakayı istenilen süre boyunca 37 derecede nemlendirilmiş karbondioksit kuvözde kuluçkaya yatırın.

Kuluçka tamamlandığında, hücreleri hasat etmek için bir hücre kazıyıcı kullanın ve 15 mililitrelik bir tüp e aktarın. İlk olarak, her numunenin 100 mikrolitresini koyun ve kontrolleri 96 kuyulu V-alt plakanın bir kuyusu içine yerleştirin. Yıkama için iki milimolar EDTA içeren 150 mikrolitre PBS ekleyin.

Renk telafisi için, her renk için Conidia olmadan bir milyon hücre yerleştirin, plaka diğer kuyularda. Eğitimsiz bırakılacak hücrelerin bir kuyu ekleyin. Yıkama için her kuyuya iki milimolar EDTA içeren 150 mikrolitre PBS ekleyin.

Daha sonra, bir yapışkan folyo ile plaka kapağı ve santrifüj 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika. Sonra, folyo çıkarın ve hızlı ve zorla ya lavabo, ya da tek kullanımlık kağıt havlu üzerinde sadece bir kez ters plaka tarafından supernatant atın. Antikor karışımı 100 mikrolitre hücreleri resuspend ve pipetleme ile iyice karıştırın.

Renk telafileri için, EDTA iki milimolar içeren PBS 100 mikrolitre ilgili hücreleri yeniden askıya, ve her kuyuiçin tek bir antikor türü ekleyin, antikor karışımı kullanılan aynı miktarda. Bir yapışkan folyo ile kaplayın ve 20 dakika boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçka. Bundan sonra, folyo çıkarın ve yıkama için her kuyuya iki milimolar EDTA içeren PBS 150 mikrolitre ekleyin.

Plakayı tekrar yapışkan folyo ile kapatın. Santrifüj 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika. Sonra folyo çıkarın ve hızlı ve zorla bir lavabo veya tek kullanımlık kağıt havlu üzerinde plaka ters tarafından supernatant atın.

2 milimolar EDTA içeren 200 mikrolitre PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu her kuyudan ayrı bir yuvarlak alt tüpe aktarın. Akış sitometresini çalıştırın ve ısınmasına izin verin. Satın alma yazılımında, yeni bir deneme oluşturun ve yeni örnekleri ayarlayın ve etiketleyin.

Metin protokolünde belirtildiği gibi, uygun floroforlar için parametreleri ve dedektörleri ayarlayın. Bu yazılımda, metin protokolünde belirtildiği gibi uygun nokta çizimlerini görüntüleyin. Hücreleri kullanarak sadece örnek, bazı hücreleri elde ve lökositler etrafında kapı ayarlayın.

Lökosit kapısına dayanarak, CD45 pozitif hücreler için kapı, SSC CD45 arsa Conidia ayırmak için. Bir nokta arsa, CD14, CD66b, kapı nötrofiller ve monositler ayrı ayrı. Bundan sonra, hücrelerden yalnızca örneklemden etiketlenmemiş Conidia'ya değiştirin.

Bir nokta arsa, anti-FITC, APC FITC, anti-FITC için set quadrants görüntü nötrofiller ve FITC sinyalleri. İstatistik görünümünü açın ve q1, Q2 ve Q4 quadrants hücrelerinin maksimum% 1 izin, quadrants ayarlayın. Monosit kapısı için bu işlemi tekrarlayın. Lökosit kapısında, en az 20.000 etkinlikle tüm örnekleri kaydedin.

İnsan nötrofiller tarafından FITC etiketli Conidia fagositoz istatistik görüşlerinden okunabilir. Bu çalışmada, aspergillus fumigateurs Conidia'nın çok sayıda birincil insan lökositile etkileşimini ölçmek için hızlı akış sitometrik yöntemi kullanılmıştır. FSC ve SSC özellikleri ile insan lökositlerinin genel bir gating, uygun antikorlar ve burada gösterilen gating stratejisi kullanılarak, pan lökosit marker, CD45 tarafından, serbest Conidia lökositlerin ayrılması takip eder.

Conidia akış sitometri sırasında neredeyse hücre büyüklüğüne ulaşabilir, özellikle şişmiş Conidia kullanırken, ve ya da uzun kuluçka süreleri, ve böylece bize analiz satın alabilirsiniz. İnsan birincil monositler ve nötrofiller Conidia'yı farklı bir şekilde ele aldığından, bu protokol bu hücre popülasyonunun, köklü hücre soy işaretleri, monositler için CD14 ve nötrofiller için CD66b ile boyanmasına dayalı ayrı bir analize olanak sağlar. Konidia içselleştiren insan birincil fagosityüzdesi kan bağışçıları arasında son derece değişken olabilir, ama aynı zamanda deneysel faktörlere bağlıdır, kuluçka süresi ve Conidia şişme durumu gibi.

Spor içselleştirme kooperatifin 0,5 saat sonra tespit edilebilir ve zamanla artar. Önceden şişmiş Conidia dinlenme sporları daha kolay alınır, kısa kuluçka zamanlarında bile. Conidia formaldehit ile sabit ise, fagositoksis yerli Conidia göre azalır.

Bu prosedürü takiben, birlikte kuluçka bağışıklık hücreleri ve Conidia supernatants toplanabilir ve eliza tarafından etkileşim bağışıklık hücreleri tarafından bir sitokin salınımı ortaya çıkarmak olup olmadığını kontrol etmek için analiz. Lütfen unutmayın, insan kanı bulaşıcı hastalıklara bulaştırabilir. Bu çalışma Hepatit B genelinde aşı gerektirir, bir biyo güvenlik kabini kullanımı, yanı sıra bir laboratuvar önlüğü eldiven giyiyor.