Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

Bu teknik, hayvan modellerinde ve insanlarda in vitro ve in vivo parametreler arasındaki korelasyonun araştırılması yoluyla kardiyak hastalıkların patofizyolojisinin aydınlatılmasını sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, çok küçük biyopsiler veya donmuş olarak saklanan örnekler kullanılarak derin miyofilament fonksiyonunun incelenmesine izin vermesidir. Bu teknik, terapötik müdahalelerin miyofilamentler üzerindeki etkisinin in vitro olarak değerlendirilmesine izin verir.

Bir deneye başlamadan önce, kardiyomiyositlerin iyi boyut, çizgi ve şekle sahip nasıl seçileceğini, yapıştırılacağını ve aktive edileceğini öğrenmek için kardiyomiyosit ekstraksiyonunu birkaç kez uygulamanız önerilir. Prosedüre başlamadan önce, odadaki test cihazının sıcaklığını 15 santigrat dereceye ayarlayın ve kuvvet dönüştürücüsünü ve motoru açın. Üç ila beş mikrogram miyokard örneğini 2,5 mililitre relax ISO çözeltisi içeren bir Petri kabında çözün ve gereksiz hücre hasarına neden olmadan dokuyu küçük parçalara hassas bir şekilde kesmek için bir neşter kullanın.

Dokunun tamamı kesildiğinde, tüm çözelti hacmini ve doku parçalarını bir Potter-Elvehjem bardağına aktarmak için kesilmiş bir pipet ucu kullanın ve dokuyu dakikada 30 ila 40 dönüşte mekanik olarak bozmak için bir öğütücü kullanın. İyi bir hücre süspansiyonu elde edildiğinde, 2.25 mililitre gevşeme ISO içeren 15 mililitrelik bir tüpe 250 mikrolitre Triton ekleyin ve elde edilen çözeltiye hücre süspansiyonunu ekleyin. Karıştırmak için tüpü üç kez nazikçe ters çevirin ve tüpü oda sıcaklığında bir dakika bekletin, ardından buz üzerinde dört dakikalık bir inkübasyon yapın.

Buz inkübasyonunun sonunda, tüpün son hacmini ek gevşeme ISO ile 15 mililitreye getirin ve tüpleri gösterildiği gibi ters çevirerek üç kez karıştırın, ardından hücreleri santrifüjleyin, ardından son üç mililitre hariç hemen hemen tüm sıvıyı dikkatlice çıkarın. Son yıkamadan sonra, süpernatanı beş ila 10 mililitre hücre süspansiyonu hacmine kadar çıkarın. Derili kardiyomiyosit seçimi için, ters çevrilmiş bir mikroskop slayt tutucusunda bir cam slaytın üzerine yerleştirilmiş bir lamel üzerine bir damla hücre süspansiyonu ekleyin ve iyi bir çizgileme deseni ve boyutuna sahip tek çubuk şeklinde bir kardiyomiyosit seçmek için 20X objektifi kullanın.

Lamel döndürmek için iki elinizi kullanın, seçilen kardiyomiyosit, uçları kuvvet dönüştürücünün ve motorun iğnesi ile aynı hizada olacak şekilde yatay olarak konumlandırılana kadar ve lamel boyunca ince bir tutkal çizgisi yerleştirmek için bir pipet ucu kullanın. Hücreyi yerine yapıştırmak için, her iki ucun etrafında bir tutkal halesi oluşturmak için kuvvet dönüştürücünün ve motorun iğne uçlarını tutkal hattına daldırın ve kuvvet dönüştürücünün iğne ucunu kardiyomiyositin bir kenarına yapışacak şekilde hızla aşağı doğru hareket ettirin. Bu işlemi motorun ucu ve hücrenin diğer ekstremitesi ile tekrarlayın.

Beş ila sekiz dakika sonra, hücrenin lamel üzerine yapıştırılmasını önlemek için iğneleri yaklaşık 15 mikrometre kaldırmak için her iki mikro manipülatörü aynı anda hareket ettirin. Aktif ve pasif kuvvetleri ve kalsiyum duyarlılığını ölçmek için, ilk deney kuyusunu 55 ila 100 mikrolitre rahatlatıcı çözelti ile doldurun ve ikinci deney kuyusunu 55 ila 100 mikrolitre aktive edici çözelti ile doldurun. Kamera yazılımını kullanarak, ilgilenilen bölgeyi net bir çizgilenme paterni ile kardiyomiyositin bir alanına ayarlayın ve sarkomer uzunluğunu 2,2 mikrometreye ayarlayın.

Kardiyomiyositin iki ucu arasındaki mesafeyi ölçün ve değeri yazılım içinde miyosit uzunluğu olarak kaydedin. Daha sonra, iğneleri hafifçe daha yükseğe hareket ettirin ve mikroskop aşamasını yavaşça hareket ettirin, böylece hücre lamel den sahnenin arkasındaki gevşetici çözeltiyi içeren kuyuya hareket eder. Hücre kalsiyum ve gevşetici solüsyonlarda sırayla ortaya çıktığında meydana gelecek iki hücre kısalmasını içeren protokolü seçin.

İzometrik bir kasılma ortaya çıkarmak için, mikroskop aşamasını kardiyomiyosit gevşetici çözeltiden aktive edici çözeltiye geçecek şekilde hareket ettirin. Kuvvet platosuna ulaştığınızda, kuvvet verilerini kaydetmeye başlayın. 10 saniye sonra hücreyi rahatlatıcı solüsyona geçirin ve test durana kadar verileri kaydedin.

Kalsiyum duyarlılığını belirlemek için, aktive edici çözeltiyi her bir kalsiyum çözeltisinden 55 ila 100 mikrolitre ile değiştirin ve verileri gösterildiği gibi kaydedin. Ölçümün sonunda, iğneleri hücreden çıkarmak için kuvvet dönüştürücüsünün ve motorun uçlarını gerin ve tutkal halesini iğne uçlarından dikkatlice çıkarmak için asetona batırılmış bir pamuklu çubuk kullanın. Uzun süreli deneylerden sonra belirli bir derecede bozulma ve kuvvet azalması beklenmesine rağmen, fonksiyonel geçirgen kardiyomiyositler içindeki aktif gerilim değerleri nispeten stabil olmalıdır.

Burada, bir miyofilament kalsiyum duyarlılığı protokolünü gerçekleştirmek için gereken sekiz kuvvet kaydından üçünün temsili kuvvet izleri gösterilmektedir. Hücreyi aktive edici çözeltiyi içeren bir kuyuya aktararak, kardiyomiyositler bir platoya ulaşana kadar kuvvet geliştirmeye başlar. Hızlı bir gevşeklik testinden sonra, sıfır kuvvetin temel değerleri elde edilebilir.

Bu eğrinin son kısmının eğimi, çapraz köprü bağlanma ve ayrılmanın görünen oranının bir ölçüsü olan kuvvet yeniden geliştirme oranının değerini belirlemek için kullanılabilir. Hücreyi gevşetici çözeltiyi içeren bir kuyuya geri aktardıktan sonra, hücre gevşer ve kuvveti düşer. Miyofilament kalsiyum duyarlılığı ve uzunluğa bağlı aktivasyon ölçümlerine ek olarak, pasif gerilimin sarkomer uzunluk bağımlılıkları ve kesit alanı başına kalsiyum aktive kuvvetin sarkomer uzunluk bağımlılıkları ve kalsiyumdan bağımsız gerilim hesaplanabilir.

Son olarak, kardiyomiyositlerin izole edilme şeklinin sonuçları önemli ölçüde etkilediğine dikkat etmek önemlidir. Kardiyak fonksiyonu in vitro olarak değerlendirmek için derili kardiyomiyositlerin kullanılması, hücre düzeyinde meydana gelen değişiklikleri açıklığa kavuşturmak ve farklı fizyolojik ve patolojik durumlarda miyofilament mekanizmalarını incelemek için önemli bir tekniktir. Bu yöntem, minimum miktarda miyokard örneği gerektirme ve çok çeşitli türlerden, kardiyak konumlardan ve patolojilerden kardiyomiyositlerin kullanımına izin verme avantajına sahiptir.