Name: Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Öğrenin derili kardiyomiyositler kullanarak kardiyak fonksiyonun in vitro değerlendirilmesini. Bu yöntem, miyofilament fonksiyonunu ve kalsiyum duyarlılığını küçük biyopsilerle analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT), Avrupa Birliği, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) ve Programa Operacional Factores de Competitividade'ye (COMPETE) UnIC (UID/IC/00051/2013) araştırma birimini finanse ettiği için teşekkür ediyor. Bu proje FEDER tarafından COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), DocNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), Norte Portugal bölgesel operasyonel programı (NORTE 2020) tarafından desteklenen, Portekiz 2020 ortaklık anlaşması kapsamında desteklenmiştir, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF), PROJE NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), Avrupa Yapısal Ve Yatırım Fonları, Lizbon bölgesel operasyonel programı 2020 tarafından desteklenen. Patrícia Rodrigues FCT (SFRH/BD/96026/2013) ve João Almeida-Coelho tarafından finanse edildi Universidade do Porto/FMUP ve FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).

Tüm hayvan deneyleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (NIH Yayın no. 85-23, revize 2011) ve Portekiz hayvan refahı yasasına (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). Yetkili yerel makamlar bu deneysel protokolü onayladılar (018833).
1. Stok çözeltisi hazırlama (Tablo 1)
<ol><li>Tablo 2'dekitalimatları izleyerek kardiyomiyositlerin izolasyonu (RELAX-ISO) için 1.000 mL rahatlatıcı çözelti hazırlayın. Yukarıdaki reaktifi ≈500 mL olarak eritin ve koh ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. Son hacmi 1000 mL'ye ayarlayın.<ol>
<li>RELAX-ISO'yi 50 mL tüplerhalinde dağıtın. -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tablo 3'tekiyönergeleri izleyerek 250 mL etkinleştirme çözeltisi hazırlayın. Yukarıdaki reaktifleri 100 mL ≈ ultra saf suda çözün. 15 °C'de 5 M KOH ile pH'ı 7,1'e ayarlayın. NOT: Genellikle istenilen pH'a ulaşmak için önemli miktarda KOH eklemek gerekir. Çözeltiyi 15 °C'ye kadar soğutmak için hacimbaliyi buzlu bir kutuya koyun.<ol>
<li>Son hacmi 250 mL'ye ayarlayın. Bu çözeltiyi rahatlatıcı çözeltiile karıştırma anına kadar manyetik karıştırıcı ile sürekli olarak karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tablo 4'tekitalimatları izleyerek 100 mL rahatlatıcı çözelti hazırlayın. Yukarıdaki reaktifleri 50 mL ≈ ultra saf suda çözün. 15 °C'de KOH 5 M ile pH'ı 7,1'e ayarlayın. NOT: Genellikle, 7.1 bir pH ulaşmak için KOH önemli miktarda eklemek için gereklidir. Çözeltiyi 15 °C'ye kadar soğutmak için hacimbaliyi buz dolu bir kutuya yerleştirin. Ölçümler sırasında kullanılan çözeltilerin iyonik mukavemeti 180 mM olarak hesaplandı.<ol>
<li>Son hacmi 100 mL'ye ayarlayın. Bu çözeltiyi aktive solüsyonu yla karıştırma anına kadar manyetik karıştırıcı ile sürekli olarak karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5.0 ile 6.0 arasında pCa çözeltisi elde etmek için Tablo 5'te sunulan oranlarda etkinleştirme ve rahatlatıcı çözümleri karıştırın.<ol>
<li>Her ikisini de karıştırırken her zaman rahatlatıcı ve aktive edici çözümler tutun.</li>
		<li>Aliquot her karışımı 2 mL mikrotüpler için. Tüm mikrotüpleri -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her protokol için farklı bir pCa çözeltisi (4,5 ila 6,0) hazırlayın.</li>
</ol>2. Kuvvet transdüserinin kalibrasyonu
NOT: Kuvvet dönüştürücüsünün kalibrasyonu, birkaç ayda bir veya kalibre edilmemiş olduğundan şüphelenilen rutin bir işlemdir. Kuvvet dönüştürücüsi son derece hassastır ve kolayca kırılır. Kalibrasyon, kardiyomiyosit yapıştırma ve temizlik dahil olmak üzere kullanımının her aşamasında nazikçe ele alınmalıdır.
<ol><li>Kuvvet dönüştürücüsünün diğer cihazdan ayrılması.</li>
	<li>Bir kelepçe yardımıyla, kuvvet transdüserini yatay olarak, iğnenin aşağıya doğru, kardiyomiyositin kuvvet geliştireceği yöne doğru işaret edecek şekilde yerleştirin. Bu bilinen ağırlıkları (elastik bant, dikiş veya pin) ile kitlelerin bir dizi asılı kolaylaştıracaktır. NOT: Ölçek faktörünün [mg/volt] kontrol etmek ve transdüser üzerinde aşırı ağırlıktan kaçınmak için bu adıma geçmeden önce kuvvet transdüserinin özelliklerini kontrol edin. Kuvvet transdüser modeli için, ölçek faktörü 50 (50 mg 1 volta karşılık gelir) ve biz 12.5 ve 250 mg arasında 5 ağırlıkkullanın.</li>
	<li>Kuvvet dönüştürücü açın ve 30 dakika boyunca ısınmaya bırakın.</li>
	<li>Kuvvet transdüserinin üzerine daha hafif kütleyi asarak ve FORCE OUT'ta ölçülen ilgili voltajı kaydederek başlayın.<ol>
<li>Bu yordamı en fazla beş ağırlık için tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuvvet transdüserine (yük) uygulanan çizim kuvveti gerilime karşı ve doğrusalolup olup olup olduğunu kontrol edin.</li>
	<li>Doğrusallık yoksa, sıfırı ayarlayın ve transdüserin devre kartında potansiyometre kazanın. Daha fazla bilgi için kendi özel yönergesini kontrol edin.<ol>
<li>Çıkış gerilimi 0,0 V okuyana kadar sıfır potansiyometreyi çevirin.</li>
		<li>Transdüser iğneüzerinde orta ağırlık tave ilgili voltajı okumak için kazanç potansiyometresini ayarlayın (örneğin, 50 mg 1 V'e karşılık gelir). Ağırlığı çıkarın ve sıfır potansiyometresini 0,0'a yeniden ayarlayın.</li>
		<li>2.6.2 adımını ağırlıklı ve ağırlıksız çıkış doğru olana kadar tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuvvet dönüştürücüsi aparata geri monte edin.</li>
</ol>3. Deneysel aparatın ayarlanması
<ol><li>Aktive edici, 4.5, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 ve rahatlatıcı çözeltilerin her birinin bir şişesini eritin ve buzüzerinde saklayın. NOT: ATP ve PCr soğuk sıcaklıklarda muhafaza edilmesi gereken labile bileşiklerdir.</li>
	<li>Mikroskobu, test cihazlarını ve ilgili bilgisayarı kullanıma hazırlayın (Şekil 1).</li>
	<li>Sıcaklığı, oda içi termometrenin 15 °C'yi okuyuyacak şekilde ayarlayın. Kiaz ve fosfataz kuluçkaları (20 °C) dışında tüm deneyleri bu sıcaklıkta gerçekleştirin.</li>
	<li>Kuvvet dönüştürücüve motoru açın.</li>
</ol>4. Derili kardiyomiyositlerin çıkarılması ve permeabilizasyonu
<ol><li>RELAX-ISO çözeltisinin 50 mL'lik buzunu çözün.</li>
	<li>Santrifüju açın ve 4 °C'ye kadar hızlı bir şekilde soğutun.</li>
	<li>2,5 mL RELAX-ISO çözeltisi içeren petri kabında 3-5 μg miyokardiyal numunenin çözülmesi.</li>
	<li>Bir neşter bıçak(Şekil 2)ile küçük parçalar halinde doku kesin. Gereksiz hücre hasarını önlemek için numuneyi kesin bir şekilde kesin olarak kesin olarak kesin.</li>
	<li>Relax-ISO çözeltisinin 2,5 mL'lik kısmını, kesilmiş pipet ucu kullanarak bir Potter-Elvehjem camına aktarın.</li>
	<li>Mekanik 30-40 rpm bir dönüş hızında bir öğütücü ile doku bozabilir. Iyi bir hücre süspansiyonu elde etmek için 2'şer s'lik için 3 kez dokuya basın.</li>
	<li>RELAX-ISO çözeltisinde Triton (250 μL Triton, 2,25 mL RELAX-ISO) 15 mL'lik bir tüpte hazırlayın ve bu çözümü hücre süspansiyonuna ekleyin.</li>
	<li>Tüpü 3 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>1 dk ve buz üzerinde 4 dakika oda sıcaklığında kuluçka.</li>
	<li>15 mL'lik tüpün tepesine RELAX-ISO ekleyerek Triton'u yıkayın; yavaşça karıştırma (tüpün 3 katı ters çevirme) ve son olarak hücreleri açılı bir santrifüjde (348 x g'de1 dk) aşağı doğru döndürür. Hücre peletinin üzerinde 3 mL'ye kadar süpernatantı çıkarın. NOT: Hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatant'ı hafifçe çıkarın. Yine de, supernatant bazı hücreler kaçınılmaz olarak kaybolur.</li>
	<li>Adım 4.10'u en az 4 kez veya Triton artıkları tarafından üretilen kabarcıklar gözlenenekadar tekrarlayın. NOT: Daha fazla yıkama adımları yapılır, daha fazla hücre atılır supernatant ile kaybolur.</li>
	<li>Son yıkamada, 5-10 mL hücre süspansiyonuna kadar süpernatantı çıkarın.</li>
</ol>5. Derili kardiyomiyositseçimi ve yapıştırma
<ol><li>Mikroskop kaydırağı tutucusundaki cam bir kaydıranın üzerine bir kapak kapağına hücre süspansiyonu damlası koyun (Şekil 1).</li>
	<li>İyi bir striation desen ve boyutu ile tek bir çubuk şeklinde kardiyomiyosit seçin(Şekil 2).</li>
	<li>Ters mikroskobun en düşük büyütmesini kullanarak kuvvet dönüştürücünün ve motorun iğne uçlarını bulun.</li>
	<li>Kapak kaymasını seçili kardiyomiyositi yatay olarak konumlandıracak şekilde döndürün, böylece uçları kuvvet transdüserinin ve motorun iğnesiyle hizalanır(Şekil 2).</li>
	<li>Bir bez ucu yardımı ile kapak kapağının yan tarafına ince bir tutkal hattı yerleştirin(Şekil 2).</li>
	<li>Her iki uç etrafında bir tutkal hale oluşturmak için kuvvet transdüser ve motor tutkal hattı içine iğne uçları batırın. NOT: 5.6 - 5.10 adımları motorlu mikropozisyonerlerin dikkatli kullanımı ile gerçekleştirilir.</li>
	<li>İğne uçlarını kardiyomiyositin odak düzlemine yakın bir şekilde hareket ettirin.</li>
	<li>Kuvvet transdüserinin iğne ucunu aşağı doğru hareket ettirin, böylece kardiyomiyositin bir kenarına yapıştırın.</li>
	<li>Motorucu ucu ve hücrenin diğer ekstremite ile bu işlemi tekrarlayın. NOT: Tutkal çok hızlı kür başlar gibi bu işlem az 2-3 dakika sürmelidir.</li>
	<li>5-8 dk sonra, hücreyi kapak kaymasına yapıştırmaktan kaçınmak için iğneleri ≈ 15 μm kaldırın. Bu aynı anda her iki mikromanipülörler yukarı hareket ederek yapılır.</li>
	<li>Tutkal tedavi etsin. Bu işlem tutkal türüne bağlı olarak 15 ila 45 dakika sürebilir. Bizim durumumuzda, kardiyomiyosit yeterli 15 dakika ≈ sonra yapıştırılmış.</li>
</ol>6. Aktif, pasif ve Ca2+ hassasiyetinin kayıt kuvveti ölçümleri
<ol><li>İlk deneysel kuyuyu rahatlatıcı solüsyon (deneysel cihazda 55-100 μL) ve ikinci deneysel kuyuyu da etkinleştirme solüsyonu ile doldurun.</li>
	<li>Kamera yazılımını kullanarak, ilgi alanını (ROI) kardiyomiyositin açık bir striasyon deseni ile bir alana yerleştirin. NOT: Kardiyak miyositlerde ameliyat sarcomere uzunluğu 1,8 ile 2,2 μm arasında değişir ve optimal sarcomere uzunluğu 2,15 μm civarındadır.</li>
	<li>Optimal sarcomere uzunluğu ayarlandıktan sonra kardiyomiyositin iki uç noktası arasındaki mesafeyi (motordan transdüser tutkal halesine, Şekil 3)ölçün (2,2 μm). Değeri yazılımdaki miyosit uzunluğu olarak kaydedin.</li>
	<li>Ölçü kardiyomiyosit genişliği ve derinliği, hücreye dik yerleştirilen bir prizma ayna yardımı ile ikinci. NOT: Prizma yoluyla hücreyi görselleştirmek için güçlü, harici bir ışık kaynağı gerekir. Prizma olmaması ve kardiyak hücrelerin eliptik bir şekle sahip olduğu varsayılsa kardiyomiyosit derinliği kardiyomiyosit genişliğinin p'i olarak çıkarılabilir.</li>
	<li>Kardiyomiyositin eliptik bir şeklini varsayarak kesit alanını (CSA, mm2)hesaplayın. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60427/60427eq1.jpg"></li>
	<li>Mikroskop aşamasını yavaşça hareket ettirin, böylece hücre kapak kaymasından sahne nin arkasında rahatlatıcı bir çözüm içeren kuyuya hareket eder. NOT: Bu yordam hücreye kolayca zarar verebilir. Hücreyi hareket ettirmeden önce iğneleri hafifçe biraz daha yukarı doğru hareket ettirin. Hücreyi çözeltiden çıkarmaktan kaçının.</li>
	<li>Hücre Ca2+ </li><li> </li><li> </li><li> </li><li><li><li> <ol><li></li><li><li></li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li> </li><li><li><li><li><li></ol><ol><li><li><li></ol><ol><li> </li><li><ol><li> </li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li></ol></li><li> <ol><li></li><li></li><li></li><li> </li><li></li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li></ol>

<ol><li>Leite-Moreira, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+compliance%3A+a+novel+adaptive+biological+mechanism+following+acute+cardiac+load%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).</li>
<li>Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+myocardial+stiffness+by+%CE%B2-adrenergic+stimulation+-+its+role+in+normal+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of myocardial stiffness by β-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart.</a> Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).</li>
<li>Cokkinos, D. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCokkinos%2C+DV+%22Introduction+to+Translational+Cardiovascular+Research%22">Introduction to Translational Cardiovascular Research</a>. , Springer International Publishing. 371-387 (2015).</li>
<li>van der Velden, J., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Disorders+and+Pathophysiology+of+Sarcomeric+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).</li>
<li>Garnier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+procedures+for+mechanical+manipulation+of+isolated+cardiac+myocytes%3A+a+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge.</a> Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).</li>
<li>Brady, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+isolated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of isolated cardiac myocytes.</a> Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).</li>
<li>Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F. Chapter 20. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFalcao-Pires%2C+I+%22Introduction+to+Translational+Cardiovascular+Research%22">Introduction to Translational Cardiovascular Research</a>. Cokkinos, D. V. 20, Springer, Cham. 371-387 (2015).</li>
<li>Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+calcium-induced+calcium+release+in+cardiomyocytes+using+a+classic+paper+by+Fabiato%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+Physiology+Education%22%5BJournal%5D)">Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato.</a> Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).</li>
<li>Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Maximum+Isometric+Force+Generated+by+Permeabilized+Skeletal+Muscle+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52695(2015).</li>
<li>Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+structure+and+theories+of+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Muscle structure and theories of contraction.</a> Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).</li>
<li>Sequeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+role+of+ADP+and+Ca%282%2B%29+in+diastolic+myocardial+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness.</a> Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).</li>
<li>Edes, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+tension+redevelopment+is+not+modulated+by+sarcomere+length+in+permeabilized+human%2C+murine%2C+and+porcine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology+Regulatory+Integrative+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes.</a> American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).</li>
<li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics%3A+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).</li>
<li>Hamdani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+titin+hypophosphorylation+importantly+contributes+to+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction+in+a+rat+metabolic+risk+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model.</a> Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).</li>
<li>Miranda-Silva, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biventricular+alterations+in+myocardial+%28reverse%29+remodelling+in+aortic+banding-induced+chronic+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2956(2019).</li>
<li>Rodrigues, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+myocardial+changes+induced+by+doxorubicin+in+the+nonfailing+dilated+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology+Heart+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle.</a> American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).</li>
<li>van der Velden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+myofilament+function+contribute+to+left+ventricular+dysfunction+in+pigs+early+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).</li>
<li>Wakili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+potential+molecular+contributors+to+atrial+hypocontractility+caused+by+atrial+tachycardia+remodeling+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs.</a> Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).</li>
<li>Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+cardiac+sarcomeric+proteins+in+the+myofibrillar+force+response+to+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch.</a> Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).</li>
<li>Falcao-Pires, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+worsens+diastolic+left+ventricular+dysfunction+in+aortic+stenosis+through+altered+myocardial+structure+and+cardiomyocyte+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness.</a> Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).</li>
<li>Lim, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthracyclines+induce+calpain-dependent+titin+proteolysis+and+necrosis+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biology+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes.</a> Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).</li>
<li>Woulfe, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+of+Isolating+Myofibrils+From+Primary+Cardiomyocyte+Culture+Suitable+for+Myofibril+Mechanical+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study.</a> Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12(2019).</li>
<li>Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+cardiac+biophysical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Cardiology+Science+Practice%22%5BJournal%5D)">Exploring cardiac biophysical properties.</a> Global Cardiology Science Practice. 2015, 10(2015).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yok.

Derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun in vitro değerlendirilmesi, fizyolojik (örn. esneme) ve patolojik bağlamda (örneğin, iskemi) kardiyomiyosit düzeyinde meydana gelen değişiklikleri açıklığa kavuşturmak için önemli bir tekniği temsil eder. Bu metodoloji, çözülmüş numunelerden elde edilen kardiyomiyositlerde fonksiyonu değerlendirmek için az miktarda miyokard igerektirecek gibi çeşitli avantajları vardır; türlerin geniş bir yelpazede kardiyomiyositler kullanarak (fareler13, sıçan1,14,15, tavşan16, domuz17, köpek18, kobay19 ve insan20) ve farklı kardiyak yerler, atria dahil, sol ve sağ ventriküller veya enfarktüs kalp belirli bir bölge. Ayrıca, bu teknik, kendi doğal yapılandırmasında düzenleyici ve kontraktil yapıların işlevini ölçerken Ca2 + ve enerji (ATP) belirli konsantrasyonları teslim sağlar.
Bu tekniğin basitliğine rağmen, bazı kritik adımlar vardır. Örnek toplama da dahil olmak üzere, başlangıçtan itibaren her adımın kalitesini garanti etmek esastır. Miyofilament proteinleri proteazlara duyarlıdır21. Bu nedenle numuneleri alındıktan hemen sonra sıvı nitrojende depolamak zorunludur. Daha önce dondurulmamış olan taze numuneler önemli ölçüde daha yüksek kuvvetler geliştirecektir, bu nedenle taze ve dondurulmuş numunelerde yapılan ölçümlerin aynı protokolde karıştırılması tavsiye edilmez. İkinci en kritik adım kardiyomiyositlerin çıkarılmasıdır. Bu işlem sırasında, çoğu zaman buz üzerinde örnek tutmak için çok önemlidir. Bir proteaz inhibitör kokteyl ekstraksiyon / permeabilizasyon sırasında protein bozulması riskini azaltmak için kullanılabilir22. Üçüncü olarak, bu adım göz ardı edildiğinde düşük kaliteli kardiyomiyositler belirttiğimiz için, numuneler hassas neşter hareketleri kullanılarak daha küçük parçalar halinde kesilmelidir. Triton yıkama arasında doğru dengeye sahip zor olduğu için başka bir kritik adım kardiyomiyosit yıkama olduğunu (hücre permeabilize ama ungluing teşvik) ve supernatant mümkün olduğunca çok sayıda hücre tutmak. Öncelikle her örnek, tür veya protokol için ekstraksiyon ve yıkama sayısını denemek önemlidir. Örneğin, elimizde, biz ZSF1 obez sıçan dokusu çıkarmalar yapıştırma sırasında bu hücreleri daha kaygan ama ölçmek için daha zor değil yapılan bir "yağlı" yönü olduğunu kaydetti. Bu sorunu aşmanın yolu, hayvan başına makul sayıda hücreye sahip olmak için daha fazla deney yapmaktı. Ayrıca, tutkal için iyi bir hücre seçmek için çok önemlidir, yani iyi bir striation ve makul uzunluğu ile. Kardiyomiyosit bu özelliklere sahip değilse, çoğunlukla iğne uçlarından kopacak veya no/düşük kuvvet geliştirecektir. Ayrıca kardiyomiyosit eki için doğru tutkal kullanmak önemlidir, yapıştırma zamanı ve iğne hücre yapıştırmak için etkinliğini göz önünde bulundurularak. Elimizde, silikon tutkal(Malzeme Tablosu)hızlı (10-15 dk) ve yeterince güçlü tedavileri. Son olarak, son kritik adım dikkatle hücre yapıştırma sonra kardiyomiyosit 5 dk kaldırma ile ilgilidir (coverslip hücre yapıştırma önlemek için) ve kuyulara taşımadan önce (mikroskop aşaması tarafından sürüklenen hücre önlemek için). Tablo 7, bu teknikle ilişkili sorun giderme olayını, altta yatan nedenleri ve sık karşılaşılan sorunların üstesinden gelmek için olası çözümleri özetler.
Bu yöntemin en önemli sınırlaması, miyofilament kontraktürünün ne kadar hızlı aktivhale/devre dışı bırakılamadığı gibi tüm soruları yanıtlayamamasıdır. In vivo ayarında, membran depolarizasyonu, hücre içi Ca2+ artışı ve miyofilamentlere difüzyonunun miyositlerin kasılması için gerçekleşmesi gerekirken, derili kardiyomiyositlerde Ca2+ miyofilamentlere difüzyon hücre Ca2+ çözeltisine batırıldığında hemen gerçekleşir. Ca2 + difüzyon Bu hızlı oranı aktivasyon / deaktivasyon analizi23miyofilamentler önyargı olacaktır.
Bu deneyler sıcaklık, çözelti pH, mekanik pertürbasyon (bolluk-re-stretch vs bolluk) ve hücre eki prosedürleri (pin kravat vs tutkal), tüm bu değişkenlerin ktr vekuvvetsarcomere uzunluğuna bağlı artış açısından literatür farklılıkları için muhasebe dahil olmak üzere farklı faktörler, etkilenir 4,12.
Tekniğin gelecekteki ilerlemesi, permeabilize kardiyomiyositler yerine sağlam fonksiyonel çalışmalar yapmayı içerir. Bu teknik kardiyomiyositler taze izole (daha önce dondurulmuş değil) güvenme dezavantajı vardır. Doğrudan bu metodoloji ile ilgili olmayan bir diğer önemli konu, ancak önemli ölçüde etkileyebilecek örnek dondurulmuş depolama maksimal dönemi ile ilgilidir. Özellikle, depo süresi boyunca miyofilament bozulma derecesini belirlemek zorunludur (yani, çıkarılan kardiyomiyositlerden elde edilen kaliteli fonksiyonel verileri sağlamak için dondurulmuş numunelerin ne kadar süreyle depolanabileceği).

Geleneksel olarak, miyokardiyal mekanik özelliklerin değerlendirilmesi papiller kaslar ve trabekülae1,2gibi çok hücreli preparatlar, çoğunlukla denenmiştir. Çok hücreli kardiyak kas şeritler hücrelerin heterojen bir nüfus içerir, oryantasyon ve kuvvet üretimi bilinmeyen bir desen ile kontraktil kardiyomiyositler de dahil olmak üzere, elektriksel aktivite ve stres / gerinim dağılımları yanı sıra çevreleyen bağ dokusu matris3,4. Kollajen olmadan bir hazırlık ve tek bir kardiyomiyosit içeren çok hassas ve kontrollü bir şekilde sarcomere uzunluğu ve çapraz köprü kontraktil özellikleri ölçümü sağlayacak5,6. Bu nedenle, son kırk yılda, çeşitli metodolojiler tek bir kardiyomiyositmekanik,kontraktil ve gevşeme özellikleri incelenmesine izin geliştirilmiştir 6,7. Bu hücrelerin kontraktil fonksiyonu kuvvetle sarcomere uzunluğu ve çapraz köprü bisiklet kinetikbağlıdır 3. Bu nedenle, sarcomere uzunluğu ve performansının yanı sıra çapraz köprü fonksiyonu ve kontraktil özelliklerinin değerlendirilmesine olanak sağladığı düşünüldüğünde, kas fonksiyonunu doğrudan tek izole kalp hücrelerinde araştırmak istenir. Ancak, μN düzeyinde kuvvet ölçümü kayıt ederken makul bir optik sarcomere çözünürlüğü ile fonksiyonel kardiyomiyositlerin izole edilmesi ve takılması hala zorlu ve gelişmekte olan3,6. Diğer zorluklar, kardiyomiyositleri yeni toplanan biyopsilerden ayırmak için kurulması gereken lojistiktir. Örneğin, insan biyopsilerinin tahmin edilemezliği deneylerin fizibilitesini tehlikeye atabilir.
Ayrıca, bilimsel prosedürler (3R ilkeleri) için hayvan deneyleri Değiştirme, Azaltma ve Arıtma ile ilgili etik kaygılar hücresel ve doku düzeyinde çalışma değişiklikleri teşvik var, tercihen insan biyopsileri, ya da küçük hayvan örnekleri. Gerçekten de karmaşıklığı daha küçük bir düzeyde in vitro kardiyak fonksiyon değerlendirmek için metodolojilerin ilerici bir arıtma tüm vücuda sonuçların uygun entegrasyonu sağlar ve klinik senaryo7bunları çevirmek . Kardiyomiyosit leri çıkarmak için -80 °C'de saklanan numunelerin kullanılması cazip bir alternatif olabilir.
Miyokardiyal doku küçük parçalar halinde kesilir ve bir havan ve bir havaneli ile homojenize edilir. Bu homojenizasyon sonucu sarkolemal hasar değişen derecelerde derili paketlenmiş ve izole hücrelerin bir süspansiyon, miyoplazm banyo ortamına maruz ve tüm hücresel bileşenlerin yıkanır nerede. Sarkoliden daha uzaktaki miyofibriller gibi yapılar korunur. Böylece, sarcomere kısaltma ve miyofibrillar cihaz ile ilişkili fonksiyonel özellikleri bozulmadan tutulur ve 8kaydedilebilir,9.
Kardiyomiyosit kuvvet ölçüm sistemi, kardiyomiyosit uzunluğunu ayarlamak için kullanılan bir elektromanyetik motor ve izometrik kardiyomiyosit daralmasını ölçen bir kuvvet dönüştürücüden oluşur. Geçirimli veya derili kardiyomiyosit, rahatlatıcı bir solüsyon ([Ca2+] < 10 nM) içeren deneysel bir odaya yerleştirilir ve biri motora, diğeri de kuvvet transdüserine bağlı silikon lu 2 iğneye yapıştırılır. Kardiyomiyosit morfolojisi ve sarcomere uzunluğunu belirlemek için optik sistem kullanılır. Deneysel protokol genellikle farklı Ca2+ konsantrasyonları içeren tampon çözeltiler üzerine bir dizi kuvvet kaydı, aktin-miyozin çapraz köprü kinetiklerinin belirlenmesi ve önceden tanımlanmış sarcomere uzunluklarında atlı kardiyomiyositlerin pasif geriliminin ölçülmesinden oluşur(Şekil 1). Permeabilize kardiyomiyositlerin sıvı nitrojende dondurulmuş miyokardiyal numunelerden (ve daha sonra -80 °C'de depolanan) izolasyonu, kesit alanı başına maksimum Ca2+aktif (aktif) kuvveti (Taktif, kN-m-2), Ca2+-ölçümü için hücresel mekanik ve protein biyokimyası kullanan bir tekniktir. bağımsız(pasif)gerilim (T pasif , kN¡m-2), miyofilamentler Ca2+duyarlılık (pCa50),miyofilamentler cooperativity (nHill), kuvvet yeniden geliştirme oranı (ktr) yanı sıra Taktifsarcomere uzunluk bağımlılıkları , Tpasif, pCa50, nHill ve ktr.
Bu protokolün amacı, kardiyomiyosit kuvvet ölçüm sisteminin potansiyelini, farklı türlerden gelen dondurulmuş numunelerden izole edilmiş tek derili kardiyomiyositlerin fonksiyonel mekanik özelliklerini değerlendirmek için güvenilir bir prosedür olarak göstermek ve özetlemektir.

<table><tbody><tr><td>Aseton</td><td>Sigma</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidrat (Na2ATP)</td> <td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum karbonat (CaCO3)</td> <td>Merck</td><td>1.02067.0500</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>VWR</td><td>24720.157</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2.6H2O)</td> <td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür çözeltisi (MgCl2 1M)</td> <td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>N, N-Bis (2-hidroksietil) taurin (BES)</td> <td>Sigma</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokreatin dissodyum tuzu hidrat (Na2PCr)</td> <td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td> <td>Merck</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit (KOH)</td> <td>Merck</td><td>8.14353.1000</td><td></td></tr><tr><td>Propiyonik asit (C3H6O2)</td> <td>Merck</td><td>8.00605.0500</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Sıkma Tüpü</td><td>Marineland</td><td>31003</td><td></td></tr><tr><td>Tritiplex (EGTA)</td> <td>Merck</td><td>1.08435.0025</td><td></td></tr><tr><td>Triton & reg; X-100 %10</td> <td>Merck</td><td>648463</td><td></td></tr><tr><td>Doku homojenleştirici (GKH GT Motor Kontrolü)</td><td>Terre Haute Glas-col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uzunluk Kontrol Cihazı (Model 315C-I)</td><td>Aurora Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuvvet Dönüştürücü (Model 403 A)</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ASI 600A</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sotware VSL (Model 900B)</td><td>Aurora Bilimsel Ters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (IX51)</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

derili kardiyomiyositler kullanarak kardiyak fonksiyonun İn vitro değerlendirilmesi

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Bu makalede, tek bir geçirimli ("derili") kardiyomiyositi izole etmek ve fonksiyonel çalışmalar yapmak için bir kuvvet ölçme aparatı ve bir motora takmak için gereken adımları açıklıyoruz. Bu çalışmalar kardiyomiyosit sertliği ölçümü (pasif kuvvet) ve farklı kalsiyum (Ca2 +)içeren çözeltiler ile belirlenmesine olanak sağlayacak, diğerleri arasında: maksimum kuvvet gelişimi, myofilament Ca2+duyarlılık (pCa50),cooperativity (nHill) ve kuvvet yeniden geliştirme oranı (ktr). Bu yöntem aynı zamanda doğrudan miyofilamentler üzerinde etkili olan ilaçların etkilerinin belirlenmesini ve eksojen rekombinant proteinlerin kardiyomiyositlerin hem aktif hem de pasif özellikleri üzerine ekspresyonunun belirlenmesini sağlar. Klinik olarak, derili kardiyomiyosit çalışmaları birçok miyokardiyal hastalığın patofizyolojisini vurgulamakta ve miyofilamentleri hedef alan terapötik müdahalelerin etkisinin in vitro değerlendirilmesi ne olanak sağlar. Bu teknik, açık kalp veya nakil cerrahisi sırasında elde edilen hayvan modellerinde in vitro ve in vivo parametreleri ile insan dokusu arasındaki korelasyonları araştırarak kardiyak patofizyolojinin açıklığa kavuşturulmasını sağlar.

Fonksiyonel permeabilize kardiyomiyositler tüm deney boyunca düzgün ve tutarlı bir striation desen ile görünmelidir. Uzun süren deneylerden sonra belli bir derecede bozulma ve kuvvet azalması beklenmese de, aktif gerilim değerleri nispeten sabit olmalıdır. Belirgin striasyon kaybı veya önemli kuvvet azalması belirtileri gösteren hücreler (&lt; 15 kN-m-2<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60427/60427fig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60427/60427fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60427/60427fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60427/60427fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60427/60427fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60427/60427fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60427/60427fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60427/60427fig4large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60427/60427fig5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60427/60427fig5large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60427/60427fig6.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60427/60427fig6large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60427/60427fig7.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60427/60427fig7large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60427/60427fig8.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60427/60427fig8large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60427/Supplementary%20File.docx" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td rowspan="3"></td><td></td><td rowspan="3"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> </td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Bu protokol, derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun ekstraksiyon ve değerlendirilmesi tekniğini adım adım tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodoloji, farelerden erkeklere kadar farklı kardiyak yerlerden toplanabilen küçük dondurulmuş biyopsiler kullanarak miyofilament fonksiyonunun ölçülmesine ve akut modülasyonuna olanak sağlar.

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Bu teknik, hayvan modellerinde ve insanlarda in vitro ve in vivo parametreler arasındaki korelasyonun araştırılması yoluyla kardiyak hastalıkların patofizyolojisinin aydınlatılmasını sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, çok küçük biyopsiler veya donmuş olarak saklanan örnekler kullanılarak derin miyofilament fonksiyonunun incelenmesine izin vermesidir. Bu teknik, terapötik müdahalelerin miyofilamentler üzerindeki etkisinin in vitro olarak değerlendirilmesine izin verir.Bir deneye başlamadan önce, kardiyomiyositlerin iyi boyut, çizgi ve şekle sahip nasıl seçileceğini, yapıştırılacağını ve aktive edileceğini öğrenmek için kardiyomiyosit ekstraksiyonunu birkaç kez uygulamanız önerilir. Prosedüre başlamadan önce, odadaki test cihazının sıcaklığını 15 santigrat dereceye ayarlayın ve kuvvet dönüştürücüsünü ve motoru açın. Üç ila beş mikrogram miyokard örneğini 2,5 mililitre relax ISO çözeltisi içeren bir Petri kabında çözün ve gereksiz hücre hasarına neden olmadan dokuyu küçük parçalara hassas bir şekilde kesmek için bir neşter kullanın.Dokunun tamamı kesildiğinde, tüm çözelti hacmini ve doku parçalarını bir Potter-Elvehjem bardağına aktarmak için kesilmiş bir pipet ucu kullanın ve dokuyu dakikada 30 ila 40 dönüşte mekanik olarak bozmak için bir öğütücü kullanın. İyi bir hücre süspansiyonu elde edildiğinde, 2.25 mililitre gevşeme ISO içeren 15 mililitrelik bir tüpe 250 mikrolitre Triton ekleyin ve elde edilen çözeltiye hücre süspansiyonunu ekleyin. Karıştırmak için tüpü üç kez nazikçe ters çevirin ve tüpü oda sıcaklığında bir dakika bekletin, ardından buz üzerinde dört dakikalık bir inkübasyon yapın.Buz inkübasyonunun sonunda, tüpün son hacmini ek gevşeme ISO ile 15 mililitreye getirin ve tüpleri gösterildiği gibi ters çevirerek üç kez karıştırın, ardından hücreleri santrifüjleyin, ardından son üç mililitre hariç hemen hemen tüm sıvıyı dikkatlice çıkarın. Son yıkamadan sonra, süpernatanı beş ila 10 mililitre hücre süspansiyonu hacmine kadar çıkarın. Derili kardiyomiyosit seçimi için, ters çevrilmiş bir mikroskop slayt tutucusunda bir cam slaytın üzerine yerleştirilmiş bir lamel üzerine bir damla hücre süspansiyonu ekleyin ve iyi bir çizgileme deseni ve boyutuna sahip tek çubuk şeklinde bir kardiyomiyosit seçmek için 20X objektifi kullanın.Lamel döndürmek için iki elinizi kullanın, seçilen kardiyomiyosit, uçları kuvvet dönüştürücünün ve motorun iğnesi ile aynı hizada olacak şekilde yatay olarak konumlandırılana kadar ve lamel boyunca ince bir tutkal çizgisi yerleştirmek için bir pipet ucu kullanın. Hücreyi yerine yapıştırmak için, her iki ucun etrafında bir tutkal halesi oluşturmak için kuvvet dönüştürücünün ve motorun iğne uçlarını tutkal hattına daldırın ve kuvvet dönüştürücünün iğne ucunu kardiyomiyositin bir kenarına yapışacak şekilde hızla aşağı doğru hareket ettirin. Bu işlemi motorun ucu ve hücrenin diğer ekstremitesi ile tekrarlayın.Beş ila sekiz dakika sonra, hücrenin lamel üzerine yapıştırılmasını önlemek için iğneleri yaklaşık 15 mikrometre kaldırmak için her iki mikro manipülatörü aynı anda hareket ettirin. Aktif ve pasif kuvvetleri ve kalsiyum duyarlılığını ölçmek için, ilk deney kuyusunu 55 ila 100 mikrolitre rahatlatıcı çözelti ile doldurun ve ikinci deney kuyusunu 55 ila 100 mikrolitre aktive edici çözelti ile doldurun. Kamera yazılımını kullanarak, ilgilenilen bölgeyi net bir çizgilenme paterni ile kardiyomiyositin bir alanına ayarlayın ve sarkomer uzunluğunu 2,2 mikrometreye ayarlayın.Kardiyomiyositin iki ucu arasındaki mesafeyi ölçün ve değeri yazılım içinde miyosit uzunluğu olarak kaydedin. Daha sonra, iğneleri hafifçe daha yükseğe hareket ettirin ve mikroskop aşamasını yavaşça hareket ettirin, böylece hücre lamel den sahnenin arkasındaki gevşetici çözeltiyi içeren kuyuya hareket eder. Hücre kalsiyum ve gevşetici solüsyonlarda sırayla ortaya çıktığında meydana gelecek iki hücre kısalmasını içeren protokolü seçin.İzometrik bir kasılma ortaya çıkarmak için, mikroskop aşamasını kardiyomiyosit gevşetici çözeltiden aktive edici çözeltiye geçecek şekilde hareket ettirin. Kuvvet platosuna ulaştığınızda, kuvvet verilerini kaydetmeye başlayın. 10 saniye sonra hücreyi rahatlatıcı solüsyona geçirin ve test durana kadar verileri kaydedin.Kalsiyum duyarlılığını belirlemek için, aktive edici çözeltiyi her bir kalsiyum çözeltisinden 55 ila 100 mikrolitre ile değiştirin ve verileri gösterildiği gibi kaydedin. Ölçümün sonunda, iğneleri hücreden çıkarmak için kuvvet dönüştürücüsünün ve motorun uçlarını gerin ve tutkal halesini iğne uçlarından dikkatlice çıkarmak için asetona batırılmış bir pamuklu çubuk kullanın. Uzun süreli deneylerden sonra belirli bir derecede bozulma ve kuvvet azalması beklenmesine rağmen, fonksiyonel geçirgen kardiyomiyositler içindeki aktif gerilim değerleri nispeten stabil olmalıdır.Burada, bir miyofilament kalsiyum duyarlılığı protokolünü gerçekleştirmek için gereken sekiz kuvvet kaydından üçünün temsili kuvvet izleri gösterilmektedir. Hücreyi aktive edici çözeltiyi içeren bir kuyuya aktararak, kardiyomiyositler bir platoya ulaşana kadar kuvvet geliştirmeye başlar. Hızlı bir gevşeklik testinden sonra, sıfır kuvvetin temel değerleri elde edilebilir.Bu eğrinin son kısmının eğimi, çapraz köprü bağlanma ve ayrılmanın görünen oranının bir ölçüsü olan kuvvet yeniden geliştirme oranının değerini belirlemek için kullanılabilir. Hücreyi gevşetici çözeltiyi içeren bir kuyuya geri aktardıktan sonra, hücre gevşer ve kuvveti düşer. Miyofilament kalsiyum duyarlılığı ve uzunluğa bağlı aktivasyon ölçümlerine ek olarak, pasif gerilimin sarkomer uzunluk bağımlılıkları ve kesit alanı başına kalsiyum aktive kuvvetin sarkomer uzunluk bağımlılıkları ve kalsiyumdan bağımsız gerilim hesaplanabilir.Son olarak, kardiyomiyositlerin izole edilme şeklinin sonuçları önemli ölçüde etkilediğine dikkat etmek önemlidir. Kardiyak fonksiyonu in vitro olarak değerlendirmek için derili kardiyomiyositlerin kullanılması, hücre düzeyinde meydana gelen değişiklikleri açıklığa kavuşturmak ve farklı fizyolojik ve patolojik durumlarda miyofilament mekanizmalarını incelemek için önemli bir tekniktir. Bu yöntem, minimum miktarda miyokard örneği gerektirme ve çok çeşitli türlerden, kardiyak konumlardan ve patolojilerden kardiyomiyositlerin kullanımına izin verme avantajına sahiptir.

in-vitro-assessment-of-cardiac-function-using-skinned-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Epikardium, kardiyovasküler gelişim ve rejenerasyon için gerekli olan multipotent kardiyovasküler progenitör hücrelerin ve parakrin faktörlerin önemli bir kaynağıdır. Burada fare embriyonik epikardiyal hücrelerini kültürlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Embriyonik From The Heart Epikardiyal Hücrelerinin Vitro Kültür

uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSC) kardiyomiyositlerini -türevlenmiş dan Burada, insan mühendisliği kalp dokusu üretimini göstermektedir. Biz hERG kanalı inhibitörü e-4031 ile büzülme kuvveti ve kasılma biçimi örnek değişiklik analiz etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, kalp ilaç taraması için sağlamlık ve uygunluğu yüksek seviyesini gösterir.

Kardiyak İlaç güvenlik Taraması için insan mühendisliği kalp dokusunun Otomatik Büzülme Analizi

Burada elektrik ve mekanik uyaranlara kardiyak Fizyoloji taklit kullanan bir hücre kesimin eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu elektromekanik stimülasyon işlem görmüş hücreleri cardiomyogenic potansiyelini artırır ve daha fazla hücre tedavisi, hastalık modelleme ve uyuşturucu taraması için umut verici bir stratejidir.

Hücrelerin Cardiomyogenic potansiyeli geliştirmek için aynı anda elektrik ve mekanik stimülasyon

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

İskemiye neden olan doku hasarının kantitatif değerlendirilmesi için bir yöntem le birlikte, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen kardiyomiyositler kullanılarak iskemik kalp hastalığı nın bir modelini saklı atıyoruz. Bu model ilaç tarama ve iskemik kalp hastalığı üzerinde daha fazla araştırma için yararlı bir platform sağlayabilir.

HiPSC Türetilmiş Kardiyomiyosit Kullanarak İskemik Kalp Hastalığı Modeli ve Kardiyomiyosit Kontraksiyonunun Video Tabanlı Karşılaştırılması

Burada, önceden ayırt edilmiş insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler, kardiyak fibroblastlar ve endotel hücrelerinden oluşan 3D kendi kendine monte edilmiş kardiyak mikrotissue dizileri oluşturmak için kullanımı kolay bir metodolojiyi açıklıyoruz. Kardiyak mikrotissues üretmek için teknik gerektiren bu kullanıcı dostu ve düşük hücre, hastalık modellemesi ve ilaç gelişiminin erken aşamaları için uygulanabilir.

İnsan iPSC Türevli Kardiyomiyositler, Kardiyak Fibroblastlar ve Endotel Hücreleri Kullanılarak 3D Kardiyak Mikrotissue Dizilerinin İmalatı

Burada, kardiyak yeniden programlama değerlendirmesi için bir Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıdaki αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fare muhabir hattının kurulmasını ve uygulanmasını açıklıyoruz. Fare zorlanmasından izole edilen yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF'ler) indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM' ler) dönüştürülerek, kalsiyum (Ca2+) akı yoluyla iCM'lerin yeniden programlama verimliliğinin ve fonksiyonel olgunlaşmasının rahat ve...

Bir GCaMP3 Muhabiri ile Kardiyak Spesifik Kalsiyum Akısını Ölçerek Kardiyak Yeniden Programlamanın İn vitro Değerlendirmesi

İnsan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin kasılma fonksiyonlarındaki ve hücresel bütünlüğündeki değişikliklerin analizi, klinik olmayan ilaç gelişimi için büyük önem taşımaktadır. Hibrit bir 96 kuyucuklu hücre analiz sistemi, klinik aşamalara güvenli bir geçiş için gerekli olan güvenilir, insanla ilgili sonuçlar için her iki parametreyi de gerçek zamanlı ve fizyolojik bir şekilde ele alır.

Preklinik Kardiyak Risk Değerlendirmesi için İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerin Yapısal ve Kasılma Değişikliklerini Değerlendirmek için Hibrit Hücre Analiz Sistemi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite taraması için hayvanların kullanılmasına bir alternatif sunar. Preklinik toksisite taramasında hiPSC-CM'lerin yaygın olarak benimsenmesinin bir sınırlaması, hücrelerin olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotipidir. Burada hiPSC-CM'lerin sağlam ve hızlı olgunlaşması için protokoller sunulmaktadır.

Olgun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit Monokatmanları Kullanılarak Yüksek Verimli Kardiyotoksisite Taraması

Burada, video tabanlı mikroskopi ile birlikte esnek bir substrat üzerine kaplanmış, 2D insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit (hiPSC-CM) monokatmanlarını kullanan non-invaziv bir kardiyak tıbbi cihaz kontraktilitesi değerlendirme yöntemini gösteriyoruz. Bu araç, kardiyak elektrofizyoloji cihazlarının kasılma özelliklerinin in vitro değerlendirilmesinde yararlı olacaktır.

2D İnsan Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositlerde Kardiyak Kontraktilite Modülasyon Tedavisinin Değerlendirilmesi

Öğrenin derili kardiyomiyositler kullanarak kardiyak fonksiyonun in vitro değerlendirilmesini. Bu yöntem, miyofilament fonksiyonunu ve kalsiyum duyarlılığını küçük biyopsilerle analiz etmenizi sağlar.

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet